Histologické metody výzkumu se používají ke studiu struktury a funkce buněk a tkání lidí, zvířat a rostlin v normálních, patologických a experimentálních podmínkách. Základem G. m. a. je - soubor metodických technik používaných při výrobě preparátů buněk a tkání pro jejich mikroskopické vyšetření. Mikroskopické studium buněk a tkání lze provádět dvěma hlavními způsoby, v závislosti na stavu studovaného objektu: studium živých buněk a tkání, studium neživých buněk a tkání, které si zachovávají svou strukturu díky speciální fixaci techniky. Studium živých objektů - vitálních (supravitálních) - umožňuje sledovat fyziologické procesy v buňkách a tkáních, jejich intravitální strukturu. Provádí se na buňkách volně suspendovaných v kapalném médiu (krevní buňky, epiteliální buňky seškrabů atd.), jakož i na buněčných a tkáňových kulturách pěstovaných na speciálních živných médiích. Předmětem intravitálního pozorování mohou být tenké, průhledné tkáňové filmy (plavecká membrána). V experimentálních studiích se využívá metoda biologických oken (implantace průhledných komůrek) a studium tkáňových implantátů v přirozeném průhledném prostředí, např. v přední oční komoře zvířat. V závislosti na daném úkolu se při vitálních studiích používají různé speciální mikroskopické metody: tmavé pole, fázový kontrast, fluorescence, polarizace, ultrafialové záření. Vitální histologické metody se používají především pro biologický a biomedicínský výzkum. Jejich široké použití je omezeno velkými technickými obtížemi spojenými s vlastnostmi přežívajících tkání. V lékařském výzkumu, zejména v praxi laboratoří anatomické patologie, se používají metody studia pevných objektů. Účelem fixace je zachování intravitální struktury buněk a tkání jejich rychlým vystavením chemickým činidlům, které brání rozvoji posmrtných změn. Výběr způsobu fixace závisí na cílech studie a vlastnostech fixovaného materiálu. K identifikaci tenkých buněčných struktur se tedy používají fixační směsi obsahující soli těžkých kovů (například sublimát), nejlepším fixativem pro cytologické účely je oxid osmičelý, který se často používá v elektronové mikroskopii. Univerzálním fixátorem je formaldehyd, používaný ve formě 10% roztoku formalínu. Aby byly stejnoměrné a úplné, musí být kousky tkáně malé a objem fixační kapaliny musí být mnohonásobně větší než objem fixovaného materiálu. Po fixaci se kusy obvykle omývají ve vodě nebo alkoholu. Pevné složky tkáně (např. vápenaté usazeniny) se odstraňují pomocí technik odvápnění. Nejrychlejší a nejsnadnější způsob přípravy tkáňového řezu, který se obvykle používá v expresní diagnostice, je kus a pořízení tkáňových řezů na mrazicím mikrotomu. Je však obtížné získat dostatečně tenké řezy, stejně jako řezy z malých předmětů a rozkládajících se tkání. Proto se kusy tkáně zpravidla nalévají do těsnicího média - nebo do celoidinu. Fixovaná látka se dehydratuje v alkoholech se zvyšující se silou, projde přechodným rozpouštědlem (xylen nebo pro parafín, alkohol-ether pro celoidin) a impregnuje se parafinem nebo celoidinem. v parafínu vám umožní získat tenčí řezy (od 5-8 do 1-2 mikron) než celoidin. Řezy pro mikroskopické vyšetření se připravují pomocí sklíčka nebo rotačního mikrotomu. Ultra tenké sekce (tloušťka od 90-100 do 5-15 nm) nezbytné pro elektronové mikroskopické studie se připravují na ultratomu. Ultratomy se také používají ve světelné mikroskopii k získání polotenkých řezů. Připravené řezy jsou obarveny, aby se jasně zvýraznily struktury buněk a tkání, které vnímají barviva odlišně. Bazická barviva - barvicí báze a jejich soli (, toluidinová modř, blankyt, bismarck hnědá) - barví tzv. bazofilní struktury (buněčná jádra, vazivo). Kyselá barviva - barvící kyseliny a jejich soli (kyselina pikrová, erytrosin) - barví acidofilní nebo oxyfilní struktury (buněčná cytoplazma, kolagen, elastická vlákna). barvení by se mělo odlišovat impregnací - speciální metodou založenou na určitých oblastech buněk a tkání k obnovení těžkých kovů (například stříbra, zlata, osmia) z jejich solí a tím k získání intenzivní barvy. Příprava histologického preparátu je ukončena jeho umístěním do médií, která zajistí zachování struktur objektu, jeho barevnosti a průhlednosti. Nejčastěji se pro tyto účely používají například organické pryskyřice.
1. Malá lékařská encyklopedie. - M.: Lékařská encyklopedie. 1991-96 2. První pomoc. - M.: Velká ruská encyklopedie. 1994 3. Encyklopedický slovník lékařských termínů. - M.: Sovětská encyklopedie. - 1982-1984.
Podívejte se, co jsou "metody histologického výzkumu" v jiných slovnících:
Metodické přístupy a metody výzkumu v lidské anatomii- Občas člověk slyší, že už není co studovat v anatomii, výzkumu, prý jsou všechna témata vyčerpána, vše, co se dalo studovat, je již nastudováno, všechny záležitosti vyřešeny. Jako by vše, co se týká stavby lidského těla, ... ... Slovník pojmů a pojmů o lidské anatomii
LABORATORNÍ VÝZKUM- LABORATORNÍ VÝZKUM. viz LABORATORNÍ STUDIE. Nejdůležitější podmínkou pro získání spolehlivých výsledků výzkumu je správný výběr objektů analýzy, jejich včasný výběr a formulace výzkumného problému. Vzorová pravidla… Choroby ryb: Příručka
I Medicine Medicína je systém vědeckých poznatků a praxe zaměřený na upevňování a udržování zdraví, prodlužování lidského života, prevenci a léčbu lidských nemocí. Aby M. splnil tyto úkoly, studuje strukturu a ... ... Lékařská encyklopedie
Způsoby studia různých objektů pomocí mikroskopu. V biologii a medicíně tyto metody umožňují studovat strukturu mikroskopických objektů, jejichž rozměry leží mimo rozlišovací schopnost lidského oka. Základem M.m.i. tvoří…… Lékařská encyklopedie
- (histologická buňka cytus + řecká doktrína logos) je založena na studiu pomocí mikroskopu strukturních znaků buněk, buněčného složení tkáňových orgánů, lidských a zvířecích tělesných tekutin v normálních a patologických procesech. C. a ... ... Lékařská encyklopedie
I Histologie (řecky histos tkáň + výuka logos) je biomedicínská věda, která studuje evoluci tkání, jejich vývoj v těle (histogenezi), strukturu, funkce a interakce u mnohobuněčných živočichů a lidí. Hlavním předmětem studia G. ...... Lékařská encyklopedie
I Vulva (vulva; pudendum femininum) vnější ženské pohlavní orgány (podle Mezinárodní anatomické nomenklatury oblast ženských pohlavních orgánů). Anatomie a fyziologie. Vulva (obr. 1) se nachází mimo stydké kosti pánve a přiléhá k nim ... ... Lékařská encyklopedie
Studiem změn způsobených v těle různými chorobnými procesy si klade za cíl svými vlastními výzkumnými metodami určit tyto chorobné procesy a jejich význam ve vztahu ke klinickému obrazu nemoci a smrti ... ... Encyklopedický slovník F.A. Brockhaus a I.A. Efron
I Biopsie (řecky bios life + opsis vidění, zrakové vnímání) intravitální odběr tkání, orgánů nebo buněčných suspenzí pro mikroskopické vyšetření pro diagnostické účely, stejně jako pro studium dynamiky patologického procesu a ovlivnění ... ... Lékařská encyklopedie
Věda, která studuje tkáně zvířat. Tkáň je skupina buněk, které jsou podobné tvarem, velikostí a funkcí a svými metabolickými produkty. U všech rostlin a živočichů, s výjimkou těch nejprimitivnějších, se tělo skládá z tkání, ... ... Collierova encyklopedie
- (z řeckého ἱστός tkáň a řeckého λόγος poznání, slovo, věda) obor biologie, který studuje stavbu tkání živých organismů. To se obvykle provádí disekcí tkáně na tenké vrstvy a použitím mikrotomu. Na rozdíl od anatomie, ... ... Wikipedie
knihy
- Mnohočetný myelom a plazmatické buněčné nemoci, Ramasami Kartik, Lonial Sagar. Kniha představuje hlavní klinické aspekty mnohočetného myelomu a dalších onemocnění plazmatických buněk. Jsou popsány laboratorní studie, patogeneze, diagnostika a léčba. Ve druhém…
Předměty studia mohou být pevné (mrtvé) nebo živé buňky a tkáně.
Ke studiu mikrostruktury surovin a produktů živočišné výroby se zpravidla používají fixované buňky a tkáně. Preparáty jsou dočasné, určené pro jednorázové studium a trvalé, které lze skladovat a opakovaně zkoumat. Kromě toho se používají celkové nebo celé přípravky.
Dočasné drogy lze vařit poměrně rychle; za tímto účelem je studovaný materiál fixován a jsou získány řezy na zmrazovacím mikrotomu, v jeho nepřítomnosti lze skalpelem nebo čepelí vytvořit tenký řez tkáně nebo orgánu. Výsledný řez se obarví, umístí na podložní sklíčko a poté se nanese kapka glycerinu a překryje se krycím sklíčkem. K detekci škrobu se používá roztok jodu v jodidu draselném: 0,5 g jodidu draselného se rozpustí v malém množství vody, přidá se 1 g krystalického jodu a doplní se vodou na 100 cm3. Několik kapek činidla se nanese na tenký kousek klobásy, sýra a jiného materiálu umístěného na podložním sklíčku, škrob se zbarví do modrofialova.
Celkové nebo úplné přípravky vyšetřeno bez získání řezu tkáně nebo orgánu. Mezi sklíčko a krycí sklíčko se například vloží film podkožní tkáně nebo rozdrcený preparát z kořene rostliny po fixaci, omytí a obarvení. K identifikaci jednotlivých strukturních prvků se fixované a obarvené kousky podkoží nebo tkáně hladkého svalstva vytrhávají jehlou na podložní sklíčko – takové přípravky se nazývají trhané. V některých případech, například při zkoumání filmu sítnice oční bulvy nebo kůže pulce, se po fixaci a umytí barvení neprovádí, protože buňky obsahují organické inkluze (pigment), které mají přirozenou barvu.
Způsob přípravy histologického preparátu. Hlavní metodou pro studium fixovaných buněk a tkání je histologická, tzn. studium obarveného řezu tkáně uzavřeného ve speciálním médiu. K získání řezů se používá zalití testovaného materiálu do parafínu nebo celoidinu, což umožňuje získat tenké řezy (5-7 mikronů, resp. 10-30 mikronů), pro rychlou přípravu řezů (40-60 mikronů), zmrazení používá se technika.
Hlavní fáze přípravy histologického vzorku jsou: odběr vzorků, fixace, promývání, dehydratace, zalití do parafínu nebo celoidinu, barvení, umístění pod krycí sklíčko.
Výběr vzorku se provádí s přihlédnutím k účelu studie a struktuře materiálu. Velikost vzorku by v průměru neměla přesáhnout 2,5-3,0 cm Vzorky jater a sleziny se odebírají s kapslí. Ze srdce jsou vyříznuty kousky síně, protože membrány jsou tenčí než v komorách a na jednom preparátu je vidět topografický vztah epikardu, myokardu a endokardu. Z ledvin, lymfatických uzlin, nadledvinek se vyříznou úseky orgánů, které jdou hluboko do povrchu kolmo k povrchu tak, aby se na preparátu odhalila kůra a dřeň. Je-li potřeba připravit preparáty změněných orgánů, vyříznou se kousky testovaného materiálu na hranici s postiženou oblastí tak, aby byla ve vzorku zahrnuta přechodová zóna léze. Vzorky z kosterních svalů by měly být řezány tak, aby svalová vlákna byla v podélných a příčných řezech. Vzorky vzorků mletého masa, tvarohu a dalších rozpadajících se vzorků nejprve vložíme do kousku gázy a převážeme nití. Je třeba mít na paměti, že při otevírání hrudní dutiny se plíce zhroutí kvůli elasticitě, výrazně ztrácejí vzdušnost, proto se do průdušnice extrahovaných dýchacích orgánů vloží skleněná nebo pryžová trubice, kterou je vzduch mírně vstřikován. . Hedvábná ligatura se aplikuje na průdušnici pod zavedenou trubicí a váže se zátěž pro úplné ponoření. Pro fixaci střev je část orgánu určená k fixaci předběžně obvázána ligaturami na obou stranách. Vzorky jsou opatřeny silnými papírovými štítky s uvedením počtu a data odběru vzorků.
fixace, těch. zachování přirozené (celoživotní) architektoniky se provádí za účelem převedení živé protoplazmy struktur do neměnného stavu. Působení fixativ se projevuje tím, že v důsledku biofyzikálních procesů dochází v tkáních a orgánech k nevratné koagulaci bílkovin. Vzorek tkáně odebraný z orgánu se co nejdříve ponoří do fixativu; poměr objemu materiálu a fixační kapaliny musí být minimálně 1:9 (obr. 3).
Fixace vede k určitému zhutnění a zmenšení objemu vzorku. Nejčastěji se pro fixaci používá 10-12% formalín, ethylalkohol, aceton. Pro přípravu uvedené koncentrace fixační tekutiny se 40% formalín zředí vodou z vodovodu. Ethylalkohol (100% absolutní, resp. 96%) se používá v případech, kdy je nutné identifikovat látky, které se rozpouštějí ve vodných fixativech (například glykogen) v řezech. V acetonu je studovaný materiál (například mozek) fixován pouze na několik hodin. Když zkoumaný orgán, jako je kostní tkáň, obsahuje vápno, provádí se odvápnění nebo kalcifikace. K tomu se malý kousek kosti spustí (je lepší zavěsit na nit) v 5-8% vodném roztoku kyseliny dusičné, který se mění 2-3krát denně. Výsledek odvápnění se posuzuje zapíchnutím tenké jehly do kosti: pokud neklade odpor, je odvápnění dokončeno. Po takovém pro-
proplachování se provádí k odstranění přebytečného množství fixačního prostředku, například po fixaci formalínem se promývání provádí tekoucí vodou z vodovodu.
Dehydratace se provádí za účelem zhutnění materiálu v ethylalkoholu se vzrůstající koncentrací: 50-70-100. Pro přípravu lihu 50% a 70% se 96% líh ředí destilovanou vodou. Pro přípravu 100% alkoholu je nutné zahřát síran měďnatý až do úplné dehydratace a přidat 96% ethylalkohol k dehydratovanému bílému prášku. V každé koncentraci alkoholu je materiál uchováván po dobu 1-24 hodin, v závislosti na velikosti kusů, struktuře orgánu; v 70% alkoholu lze materiál skladovat několik dní.
vyplnit se provádí v takovém médiu, že zkušební vzorek ztuhne, což umožňuje získat tenké řezy. K tomu použijte parafín (impregnace po dobu 1-4 hodin), celloidin (impregnace po dobu tří týdnů). Při odhalování tuků a pro studium volných tkání a orgánů se používá nalévání do želatiny.
plátky přijímat na saních nebo rotačních mikrotomech. Nejtenčí řezy (5-7 mikronů) mohou být vyrobeny z materiálu zalitého v parafínu. Z materiálu plněného celoidinem se připraví řezy o tloušťce 15-20 mikronů. Ke studiu mikrostruktury surovin a produktů živočišného původu se zpravidla používá mrazicí technika. To urychluje přípravu přípravku, protože odpadá dlouhé fáze dehydratace a lití. Po fixaci a umytí se kousky předmětu umístí na mokrý podstavec mrazícího mikrotomu a získají se řezy o tloušťce 40-60 μm. Řezy se přenesou štětcem do vody, kde se narovnají a získají vzhled nejtenčích našedlých střepů.
Barvení sekcí prováděné pro zvýšení kontrastu různých struktur v přípravcích určených pro zkoumání ve světelném mikroskopu. V procesu barvení probíhají složité chemické a fyzikální procesy, proto se při volbě metody bere v úvahu selektivní afinita buněčných struktur k určitým barvivům s různými fyzikálně-chemickými vlastnostmi.
Existují barviva základní (bazální), kyselá a speciální. Struktury obarvené základními barvivy se nazývají bazofilní, kyselá barviva - oxyfilní, acidofilní, eozinofilní.
Ze základních (bazálních) barviv se používá hematoxylin, který barví chromatin jádra a další struktury obsahující bílkovinu modře nebo fialově; karmín, zbarvení jádra do světle červené, safranin - tmavě červená barva, thionin - modrá barva.
Z kyselých barviv se používá eosin (barví cytoplazmu do růžova), kyselina pikrová (žlutá), fuchsin (cihlová barva), indigokarmín (modrá).
Při studiu mikrostruktury surovin a produktů živočišné výroby se nejčastěji používá kombinované barvení hematoxylinem a eosinem. K tomu se řezy z vody přenesou na 1-3 minuty do roztoku hematoxylinu; Promyty ve vodě po dobu 20-30 minut, umístěny do roztoku eosinu na 3-5 minut a promývány vodou po dobu 3-5 minut. Zbývající voda se odstraní filtračním papírem, na 1-2 minuty se aplikuje kapka 96% ethanolu a dehydratuje se ve 25% roztoku kyseliny karbolové v xylenu nebo toluenu. Poté se na řeznou ránu nanesou 1-2 kapky balzámu a překryjí se krycím sklíčkem.
Z barviv barvících tukové inkluze se často používá Sudan 111. Pro přípravu roztoku barviva v 95 cm 3 85% ethylalkoholu přidáme 5 cm 3 acetonu a zaléváme prášek Sudan III, dokud nezískáme nasycený roztok (barvivo musí být obsaženy v přebytku). Směs se zahřeje na 50 % C a zfiltruje. Řezy získané na mrazicím mikrotomu se umístí na 1-2 minuty do 50% ethanolu a poté na 25 minut do Sudan III. Řezy se opláchnou v 50% alkoholu, promyjí se destilovanou vodou a zalijí se do glycerol-želatiny.
Kapky neutrálního tuku se zbarvují do oranžova v důsledku rozpuštění Sudan III v tucích. Tukové inkluze mohou být také detekovány s kyselinou osmiovou, zatímco tukové struktury jsou zbarveny černě.
Závěr pod krycím sklíčkem provádí v prostředí, které nepropouští vzduch a je schopné udržet řez po dlouhou dobu. Obarvené řezy se dehydratují v alkoholech se zvyšující se silou a umístí pod krycí sklíčko do jedle, kanadského balzámu nebo glycerol-želatiny (přípravek by neměl přijít do styku s alkoholy a xylenem).
Příprava vzorků pro elektronovou mikroskopii. Ke studiu biologických objektů se používají dva typy elektronových mikroskopů: transmisní (transmisní) a skenovací (rastrový).
Princip zpracování předmětu pro zkoumání v transmisním elektronovém mikroskopu je založen na stejných principech jako u optických mikroskopů: odběr vzorků, fixace, mytí, dehydratace, lití, příprava ultratenkých řezů, kontrastování.
Výběr vzorku se provádí s přihlédnutím k účelu studie a struktuře materiálu, při dodržení stejných pravidel jako u světelné mikroskopie. Objem kusů studovaného materiálu by neměl přesáhnout 1 mm 3 . Hlavním účelem fixace je udržet tkáň co nejblíže k životu.
Fixace Provádí se pro lepší zachování struktur, proto je nutné používat činidla s určitým pH a izotonicitou, jejichž hodnoty jsou určeny typem fixované tkáně. Proces fixace se provádí ve dvou fázích: prefixace a postfixace. Pro prefixaci se používá roztok 2,5-3% roztoku glutaraldehydu (pH 7,2-7,4), doba fixace je 2-4 hod. Postfixace se provádí ve 2% roztoku (pH 7,2-7,4) - 1- 2 hod. Pro zachování intravitální struktury se doporučuje použít nízkoteplotní fixativ (0-4 °C) a připravit fixativa na roztocích fosfát-pufr, kakodylát, veronal-acetát.
proplachování provádí se lihem 30% studeným 5-7x, předmět se ponechá v každé porci lihu 30 minut, tzn. vymyté z fixativu do takového stavu, kdy ustane oxidační působení fixativu.
Dehydratace provádět s ethylalkoholy se zvyšující se koncentrací: 30, 50, 70, 96, 100 % po dobu 30 minut. U některých způsobů lití se pro odvodnění doporučuje přidání acetonu a propylenoxidu.
vyplnit provádí se v epoxidových pryskyřicích (araldit, epon atd.). Polymerace pryskyřic v kapslích se provádí v termostatu při 60 °C do vytvrzení zpravidla během 1-2 dnů.
Ultratenké sekce se získávají pomocí skleněných nožů na ultramikrotomu; za tímto účelem se epoxidové bloky brousí ve formě čtyřstěnné komolé pyramidy. Sériové našedlé řezy se umístí do lázně s 10% ethanolem. Výsledné profily jsou namontovány na měděné nebo palladiové sítě, na jejichž povrchu je předběžně nanesen formvarový film. Pro odhalení potřebných struktur jsou řezy na sítích ošetřeny roztoky citrátu olovnatého a acetátu uranylu.
Pro rastrovací elektronová mikroskopie testovaný vzorek je fixován, dehydratován, v závislosti na účelu studie, pomocí výše uvedených fixativ. Po dehydrataci se vzorek nalepí na předmět držáku, umístí se do naprašovací jednotky a potáhne se velmi tenkou vrstvou zlata nebo platiny. Na rozdíl od transmisní elektronové mikroskopie může rastrovací elektronová mikroskopie používat korozivní přípravky: předmět studia se zalije některými vytvrzovacími látkami a poté se zkoumají odlitky a povrchy. Studují také repliky získané zmrazením – čipováním. V tomto případě se zkoumá otisk štěpnosti povrchu předmětu. Pro zvýšení kontrastu je třeba repliky zastínit nástřikem kovových částic (zlato, platina) nebo uhlí.
testové otázky
- 1. Jaké metody se používají při studiu buněčných struktur, tkání a orgánů?
- 2. Jaká základní pravidla dodržovat při odběru vzorků pro přípravu histologických preparátů?
- 3. Jaké jsou vlastnosti přípravy preparátů z kostní tkáně?
- 4. Jak je zkušební materiál fixován?
- 5. Co se používá k dehydrataci přípravků?
- 6. Jaká média se používají k nalévání zkušebního materiálu?
- 7. Jaké barvivo se používá k detekci tukové tkáně?
- 8. Jaká je nejčastěji používaná metoda krájení a proč?
- 9. Vyjmenujte hlavní fáze přípravy preparátů pro transmisní a rastrovací elektronovou mikroskopii.
Histologie - ("gistos" v řečtině - tkáň, logis - učení) Toto je věda o struktuře, vývoji a životní činnosti tkání mnohobuněčných organismů a lidí. Předměty, které jsou předmětem této vědy, jsou pouhým okem nepřístupné. Proto je historie histologie úzce spjata s historií vytváření takových přístrojů, které nám umožňují studovat nejmenší předměty pouhým okem. 2
Histologie je konvenčně rozdělena do následujících částí: n 1. Cytologie je věda o buňce. n 2. Embryologie je věda o vývoji, od počátku až po úplné vytvoření organismu. n 3. Obecná histologie - nauka o obecných vzorcích tkání. n 4. Soukromá histologie - studuje stavbu, vývoj orgánů a systémů.
CYTOLOGIE - (řecky κύτος "buňka" a λόγος - "studium", "věda") n Odvětví biologie, které studuje živé buňky, jejich organely, jejich strukturu, fungování, procesy buněčné reprodukce, stárnutí a smrti. čtyři
EMBRYOLOGIE n (z jiného -řec. ἔμβρυον - embryo, embryo + -λογία z λόγος - učení) je věda, která studuje vývoj embrya. 5
Historie vytvoření buněčné teorie 1590. Jansen vynalezl mikroskop, u kterého bylo zvětšení zajištěno spojením dvou čoček. 1665. Robert Hooke poprvé použil termín buňka. 1650-1700 let. Anthony van Leeuwenhoek poprvé popsal bakterie a další mikroorganismy. 1700-1800 let. Bylo publikováno mnoho nových popisů a nákresů různých tkání, především rostlinných. V roce 1827 Karl Baer objevil vejce u savců. 1831-1833 let. Robert Brown popsal jádro v rostlinných buňkách. 1838-1839 let. Botanik Matthias Schleiden a zoolog Theodor Schwann spojili myšlenky různých vědců a formulovali buněčnou teorii, která předpokládala, že základní jednotkou struktury a funkce v živých organismech je buňka. 1855 Rudolf Virchow ukázal, že všechny buňky vznikají v důsledku buněčného dělení.
Historie vytvoření buněčné teorie 1665. Při zkoumání části korku pod mikroskopem zjistil anglický vědec, fyzik Robert Hooke, že se skládá z buněk oddělených přepážkami. Tyto buňky nazval "buňky"
Historie vzniku buněčné teorie V 17. století Leeuwenhoek zkonstruoval mikroskop a otevřel lidem dveře do mikrokosmu. Před očima užaslých badatelů se mihla celá řada nálevníků, vířníků a dalších drobných živých tvorů. Ukázalo se, že jsou všude – tyto nejmenší organismy: ve vodě, v hnoji, ve vzduchu a prachu, v zemi a okapech, v hnijícím odpadu živočišného a rostlinného původu.
Historie vzniku buněčné teorie 1831-1833. Robert Brown popsal jádro v rostlinných buňkách. V roce 1838 na jádro upozornil německý botanik M. Schleiden a považoval ho za původce buňky. Podle Schleidena se jadérko kondenzuje z granulární látky, kolem které se tvoří jádro, a kolem jádra - buňky, a jádro může v procesu tvorby buněk zaniknout.
Historie vzniku buněčné teorie Německý zoolog T. Schwann ukázal, že i živočišné tkáně se skládají z buněk. Vytvořil teorii, že buňky obsahující jádra představují strukturální a funkční základ všeho živého. Buněčnou teorii struktury formuloval a publikoval T. Schwann v roce 1839. Její podstatu lze vyjádřit v následujících ustanoveních: 1. Buňka je základní strukturní jednotkou struktury všech živých bytostí; 2. Buňky rostlin a živočichů jsou nezávislé, navzájem homologní co do původu a struktury. Každá buňka funguje nezávisle na ostatních, ale společně se všemi. 3. Všechny buňky vznikají z bezstrukturní mezibuněčné látky. (Omyl!) 4. Životní činnost buňky určuje obal. (Chyba!)
Historie vzniku buněčné teorie Německý lékař R. Virchow v roce 1855 zobecnil: buňka může vzniknout pouze z předchozí buňky. To vedlo k uvědomění si skutečnosti, že růst a vývoj organismů je spojen s dělením buněk a jejich další diferenciací, vedoucí ke vzniku tkání a orgánů.
Historie vytvoření buněčné teorie Karlem Baerem V roce 1827 Karl Baer objevil vajíčko u savců a dokázal, že vývoj savců začíná oplodněným vajíčkem. To znamená, že vývoj jakéhokoli organismu začíná jedním oplodněným vajíčkem, buňka je vývojovou jednotkou.
Historie vzniku buněčné teorie 1865 Byly publikovány zákony dědičnosti (G. Mendel). 1868 objeveny nukleové kyseliny (F. Miescher) 1873 objeveny chromozomy (F. Schneider) 1874 objevena mitóza v rostlinných buňkách (I. D. Chistyakov) 1878 objeveno mitotické dělení živočišných buněk (W. Fleming, P I. Peremezhko) 1879 Fleming - chování chromozomů při dělení. 1882 Meióza objevena v živočišných buňkách (W. Fleming) 1883 Bylo prokázáno, že počet chromozomů v pohlavních buňkách je dvakrát menší než v somatických buňkách (E. Van Beneden) 1887 Meióza byla objevena v rostlinných buňkách (E. Strasburger) 1898 Golgi objevil síťový aparát buňky, Golgiho aparát. 1914 Byla formulována chromozomová teorie dědičnosti (T. Morgan). 1924 Vyšla přírodovědná teorie o vzniku života na Zemi (A. I. Oparin). 1953 Byly formulovány představy o struktuře DNA a byl vytvořen její model (D. Watson a F. Crick). 1961 Stanovena povaha a vlastnosti genetického kódu (F. Crick, L. Barnet, S. Benner).
Hlavní ustanovení moderní buněčné teorie 1. Buňka je elementární živý systém, jednotka struktury, životní činnosti, rozmnožování a individuálního vývoje organismů. 2. Buňky všech živých organismů jsou homologní, jednotné ve struktuře a původu. 3. Tvorba buněk. Nové buňky vznikají pouze dělením již existujících buněk. 4. Buňka a organismus. Buňka může být nezávislý organismus (prokaryota a jednobuněčná eukaryota). Všechny mnohobuněčné organismy jsou tvořeny buňkami. 5. Funkce buněk. V buňkách probíhá metabolismus, dráždivost a dráždivost, pohyb, rozmnožování a diferenciace. 6. Buněčná evoluce. Buněčná organizace vznikla na úsvitu života a prošla dlouhou cestou evolučního vývoje od bezjaderných forem (prokaryota) k jaderným formám (eukaryota).
METODY MIKROSKOPIE HISTOLOGICKÝCH VZORKŮ 1. Světelná mikroskopie. 2. Ultrafialová mikroskopie. 3. Fluorescenční (luminiscenční) mikroskopie. 4. Fázová kontrastní mikroskopie. 5. Mikroskopie v temném poli. 6. Interferenční mikroskopie 7. Polarizační mikroskopie. 8. Elektronová mikroskopie. 17
Mikroskop n Tento optický přístroj umožňuje pozorování malých předmětů. Zvětšení obrazu je dosaženo soustavou čoček objektivu a okuláru. Zrcadlo, kondenzor a clona usměrňují světelný tok a regulují osvětlení objektu. Mechanická část mikroskopu obsahuje: stativ, stolek na předměty, makro- a mikrometrické šrouby, držák tubusu. osmnáct
Speciální metody mikroskopie: - mikroskop s fázovým kontrastem - (pro studium živých nebarvených předmětů) - mikroskopie umožňuje studovat živé i nebarvené předměty. Při průchodu světla barevnými předměty se mění amplituda světelné vlny a při průchodu světla nebarevnými předměty se mění fáze světelné vlny, čehož se využívá k získání vysoce kontrastního obrazu ve fázově kontrastní a interferenční mikroskopii. - mikroskop v tmavém poli (pro studium živých neposkvrněných předmětů). Je použit speciální kondenzor, který zvýrazní kontrastní struktury nelakovaného materiálu. Mikroskopie v temném poli umožňuje pozorovat živé objekty. Pozorovaný objekt se jeví jako osvětlený v tmavém poli. V tomto případě paprsky z osvětlovače dopadají na objekt ze strany a do čoček mikroskopu se dostávají pouze rozptýlené paprsky. 19
Speciální metody mikroskopie Luminiscenční mic-p (pro studium živých nebarvených objektů) Mikroskopie se používá k pozorování fluorescenčních (luminiscenčních) objektů. Ve fluorescenčním mikroskopu prochází světlo z výkonného zdroje dvěma filtry. Jeden filtr blokuje světlo před vzorkem a umožňuje světlu o vlnové délce, která excituje vzorek, aby fluoreskoval. Druhý filtr umožňuje průchod světla o vlnové délce emitovaného fluorescenčním objektem. Fluorescenční objekty tedy absorbují světlo jedné vlnové délky a vyzařují světlo v jiné oblasti spektra. -ultrafialová schopnost m-pa) mic-p (zvyšuje rozlišení -polarizace mic-p (pro výzkumné objekty s uspořádaným uspořádáním molekul - kostra, sval, kolagenová vlákna atd.) mikroskopie - tvorba obrazu nezbarvených anizotropních struktur ( např. jako kolagenová vlákna a myofibrily).20
Speciální metody mikroskopie - interferenční mikroskopie (ke stanovení suchého zbytku v buňkách, stanovení tloušťky předmětů) - mikroskopie kombinuje principy fázově kontrastní a polarizační mikroskopie a používá se k získání kontrastního obrazu nebarvených předmětů. Speciální interferenční optika (Nomarského optika) našla uplatnění v mikroskopech s diferenciálním interferenčním kontrastem. C. Elektronová mikroskopie: -transmise (studium objektů prostřednictvím přenosu) -scanning (studium povrchu objektů) Teoreticky je rozlišení přenosu EM 0,002 nm. Reálné rozlišení moderních mikroskopů se blíží 0,1 nm. Pro biologické objekty je EM rozlišení v praxi 2 nm. 21
Speciální mikroskopické techniky Transmisní elektronový mikroskop se skládá ze sloupce, kterým ve vakuu procházejí elektrony emitované katodovým vláknem. Připraveným vzorkem prochází elektronový paprsek fokusovaný prstencovými magnety. Charakter rozptylu elektronů závisí na hustotě vzorku. Elektrony procházející vzorkem jsou zaostřeny, pozorovány na fluorescenčním stínítku a zaznamenány pomocí fotografické desky. K získání trojrozměrného obrazu povrchu studovaného předmětu se používá rastrovací elektronový mikroskop. Ke studiu vnitřní struktury buněčných membrán se používá metoda čipování (zmrazování-štěpení). Buňky se zmrazí při teplotě kapalného dusíku v přítomnosti kryoprotektiva a použijí se k výrobě čipů. Roviny štěpení procházejí hydrofobním středem lipidové dvojvrstvy. Odkrytý vnitřní povrch membrán je zastíněn platinou, výsledné repliky jsou studovány na skenovacím EM. 22
Speciální (nemikroskopické) metody: 1. Cyto- neboli histochemie - podstatou je využití přísně specifických chemických reakcí s lehkým konečným produktem v buňkách a tkáních ke stanovení množství různých látek (bílkoviny, enzymy, tuky, sacharidy, atd.). Lze aplikovat na úrovni světelného nebo elektronového mikroskopu. 2. Cytofotometrie - metoda se používá v kombinaci s 1 a umožňuje kvantifikovat cytohistochemickou metodou identifikované proteiny, enzymy apod. 3. Autorradiografie - do těla jsou vpravovány látky obsahující radioaktivní izotopy chemických prvků. Tyto látky jsou součástí metabolických procesů v buňkách. Lokalizace, další pohyb těchto látek v orgánech se zjišťuje na histologických preparátech zářením, které je zachyceno fotografickou emulzí nanesenou na preparát. 4. Rentgenová difrakční analýza - umožňuje určit množství chemických prvků v buňkách, studovat molekulární strukturu biologických mikroobjektů. 24 5. Morfometrie - měření velikosti biol. struktur na buněčné a subcelulární úrovni.
Speciální (nemikroskopické) metody 6. Mikrourgie - provádění velmi jemných operací s mikromanipulátorem pod mikroskopem (transplantace jádra, zavádění různých látek do buněk, měření biopotenciálů atd.) 6. Metoda kultivace buněk a tkání - v živných médiích nebo v difuzních komorách, implantovaných do různých tělesných tkání. 7. Ultracentrifugace - frakcionace buněk nebo subcelulárních struktur centrifugací v roztocích různé hustoty. 8. Experimentální metoda. 9. Způsob transplantace tkání a orgánů. 25
Fixace zachovává strukturu buněk, tkání a orgánů, zabraňuje jejich bakteriální kontaminaci a enzymatickému trávení a stabilizuje makromolekuly jejich chemickým síťováním. 32
Fixační tekutý formalín, alkoholy, glutaraldehyd - Nejběžnější fixativa; Kryofixace - Nejlepší uchování struktur je zajištěno okamžitým zmrazením vzorků v kapalném dusíku (-196 °C); Lyofilizace - malé kousky tkáně jsou podrobeny rychlému zmrazení, což zastaví metabolické procesy. Dehydratace - standardním postupem odstraňování vody je dehydratace v alkoholech se vzrůstající koncentrací (od 70 do 60 %). Výplň - činí látku odolnou, zabraňuje jejímu drcení a mačkání při řezání, umožňuje získat střihy standardní tloušťky. Nejběžnějším zalévacím médiem je parafín. Používá se také celoidin, plastová média a pryskyřice. 33
Dehydratace připravuje fixovanou tkáň na penetraci zalévacího média. Voda z živé tkáně, stejně jako voda z fixačních směsí (většina fixativů jsou vodné roztoky) musí být po fixaci zcela odstraněny. Standardním postupem odstraňování vody je dehydratace v alkoholech o síle 60° až 100°. 34
Plnění je nezbytný postup, který předchází přípravě řezů. Výplň činí tkaninu odolnou, zabraňuje jejímu drcení a mačkání během řezání a umožňuje získat tenké úseky standardní tloušťky. Nejběžnějším zalévacím médiem je parafín. Používá se také celoidin, plastová média a pryskyřice. 35
Rotační mikrotom. 40 n Bloky obsahující kus orgánu jsou upevněny v pohyblivém držáku předmětu. Po jejím spuštění zůstanou na noži sériové řezy, které se z nože vyjmou a namontují na podložní sklíčko pro další zpracování a mikroskopii.
Metody histosekčního barvení: n Nukleární (základní): n hematoxylin - barví n n n n jádra modře; hematoxylin železa; azur II (fialově); karmín (v červené); safranin (červeně); methylová modř (na modrou); toluidin (v modré barvě); thionin (v modré barvě). n Cytoplazmatická- (kyselina): n eosin - v růžové barvě; n erythrosin; n oranžové "G" ; n kyselý fuchsin - do červena; n kyselina pikrová - žlutá; n Kongo - červená - až červená 44
SPECIÁLNÍ Metody barvení histosekcí n Sudan III – oranžové barvení lipidů a tuků; n kyselina osminová - zbarvení lipidů a tuků do černa; n orcein - hnědé zbarvení elastických vláken; n dusičnan stříbrný - impregnace nervových prvků v tmavě hnědé barvě. 45
Buněčné struktury: n OXYFILIAN schopnost barvit se do růžova kyselými barvivy n Basophilian schopnost barvit se modře bazickými barvivy n Neutrofilie - n schopnost barvit se do fialova kyselými a bazickými barvivy. 47
1
Buňka n je elementární živý systém skládající se z cytoplazmy, jádra, membrány a je základem pro vývoj, stavbu a život živočišných a rostlinných organismů.
Glykokalyx je epimembránový komplex složený ze sacharidů vázaných na proteiny a sacharidů vázaných na lipidy. Funkce n Recepce (hormony, cytokiny, mediátory a antigeny) n Mezibuněčné interakce (podrážděnost a rozpoznávání) n Parietální trávení (mikroklky hraničních buněk střeva)
Funkce cytolematu: - vymezovací; - aktivní a pasivní transport látek v obou směrech; - funkce receptorů; kontaktu se sousedními buňkami.
Hlavní Výzkumné objekty jsou histologické preparáty a hlavní výzkumnou metodou je mikroskopie.
Histologický preparát by měl být dostatečně průhledný (tenký) a kontrastní. Vyrábí se z živých i mrtvých (pevných) struktur. Preparátem může být suspenze buněk, nátěr, otisk, film, celkový preparát a tenký řez.
Proces výroby histologických preparátů pro mikroskopické studie zahrnuje následující hlavní kroky: 1) odebrání materiálu a jeho fixace; 2) zhutňování materiálu; 3) příprava sekcí; 4) barvení nebo kontrastní řezy; 5) závěr sekcí.
K barvení se používají speciální histologická barviva s různými hodnotami pH: kyselé, neutrální a zásadité. Jimi obarvené struktury se nazývají oxyfilní, neutrofilní (heterofilní) a bazofilní.
Jaké metody používá histologická věda? Jsou poměrně četné a rozmanité:
Mikroskopie.
Světelná mikroskopie. Moderní mikroskopy mají vysoké rozlišení. Rozlišení je definováno jako nejmenší vzdálenost (d) mezi dvěma sousedními body, které lze vidět samostatně. Tato vzdálenost závisí na vlnové délce světla (λ) a je vyjádřena vzorcem: d = 1/2 λ.
Minimální vlnová délka viditelné části spektra je 0,4 µm. Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu je tedy 0,2 µm a celkové zvětšení dosahuje 2500krát.
ultrafialová mikroskopie . Vlnová délka ultrafialového světla je 0,2 µm, proto je rozlišení ultrafialového mikroskopu 0,1 µm, ale protože ultrafialové záření je neviditelné, je pro pozorování studovaného objektu zapotřebí luminiscenční stínítko.
Fluorescenční (luminiscenční) mikroskopie. Krátkovlnné (neviditelné) záření, které je absorbováno řadou látek, excituje jejich elektrony, které vyzařují světlo o delší vlnové délce a stávají se viditelnou částí spektra. Tím je dosaženo zvýšení rozlišení mikroskopu.
Fázová kontrastní mikroskopie umožňuje vyzařovat nezbarvené předměty.
Polarizační mikroskopie používá se ke studiu architektoniky histologických struktur, jako jsou kolagenová vlákna.
elektronová mikroskopie umožňuje studovat objekty desetitisíckrát zvětšené.
Mikrofotografie a mikrofilmografie . Tyto metody umožňují studovat pevné objekty na fotografiích a živé mikroskopické objekty v pohybu.
Metody kvalitativního a kvantitativního výzkumu.
Histo –a cytochemie , včetně kvantitativní, umožňuje kvalitativní analýzu studovaných objektů na tkáňové, buněčné a subcelulární úrovni.
Cytospektrofotometrie Umožňuje studovat kvantitativní obsah určitých biologických látek v buňkách a tkáních na základě absorpce světla určité vlnové délky barvivem s nimi spojeným.
Diferenciální centrifugace umožňuje oddělit obsah buněk, které se od sebe liší svou hmotností.
Radiografie Je založena na zahrnutí radioaktivní značky (například radioaktivního jódu, H³-thymidinu atd.) do metabolického procesu.
Morfometrie umožňuje měřit plochy a objemy buněk, jejich jader a organel pomocí okulárových a objektových mikrometrů a speciálních mřížek.
Počítačová aplikace pro automatické zpracování digitálního materiálu.
Metoda tkáňových kultur je udržování životaschopnosti a dělení buněk a tkání mimo tělo. K tomu se používají speciální nádoby s živným médiem, ve kterých jsou vytvořeny všechny nezbytné podmínky pro životně důležitou činnost buněk. Pomocí této metody je možné studovat diferenciaci a funkční vývoj buněk, zákonitosti jejich maligní transformace a vývoj nádorového procesu, mezibuněčnou interakci, poškození buněk a tkání viry a mikroorganismy, vliv léčiv na metabolické procesy procesy v buňkách a tkáních atd.
Intravitální (vitální) barvení používá se ke studiu jevů fagocytózy a aktivity makrofágů, filtrační kapacity ledvinových tubulů atd.
Metoda transplantace tkání. Tato metoda se používá ke studiu chování buněk a jejich morfofunkčního stavu, když jsou transplantovány do jiného organismu. Tato metoda se například používá k udržení zvířat vystavených smrtelným dávkám záření.
Mikromanipulace. Tato metoda se uplatnila v molekulární biologii, genetickém inženýrství a také při klonování, kdy se z vajíčka s haploidní sadou chromozomů pomocí mikromanipulátoru odstraní jádro a do něj se transplantuje jádro somatických buněk s diploidní sadou chromozomů.
Existuje mnoho výzkumných metod, mezi nimiž vynikají: pozorování živých embryí pomocí filmu a videozáznamu (využívá se především v experimentu). K tomu slouží speciální mikrofotografický přístroj, který je napojen na tepelnou komoru, ve které se embryo vyvíjí. Při studiu vývoje kuřecího embrya například uděláte okénko ve skořápce, které je uzavřeno průhlednou deskou. Tato metoda umožnila vysledovat a zpřesnit dynamiku změn tvaru a velikosti embryí v procesu vývoje.
Metoda pevných řezů embrya pomocí světelné a elektronové mikroskopie, historadioautografie, histo- a imunocytochemie. Tyto metody umožňují analyzovat tkáňové a intracelulární změny v dynamice vývoje částí embrya. Pomocí histo- a imunocytochemických metod jsou studovány biochemické procesy probíhající v embryonálních buňkách - syntéza DNA, RNA, proteinů, proteinů specifických receptorů atd. Pomocí těchto metod byly získány důležité informace o diferenciaci buněk a tkání ve vývoji embryí a plodů.
Metoda značení, navržený v roce 1925 W. Vogtem (1888-1941), umožňuje studovat buněčné pohyby ve vyvíjejícím se embryu. K tomu se používají markery, které jsou pro embrya netoxické (například neutrální červená, částice dřevěného uhlí), stejně jako protilátky proti určitým proteinům. Při použití protilátek se využívá jejich schopnosti kombinovat se s fluorescenčním barvivem a zárodečnými proteiny. Pomocí fluorescenční mikroskopie se sleduje distribuce barviva a studuje se dynamika syntézy proteinů ve vyvíjejících se tkáních embrya.
Mikrochirurgické metody byly vyvinuty na počátku 20. století představiteli školy G. Spemanna (1869-1941). Zahrnovaly: odstranění skořápek zvířecích vajec, transplantaci částí jednoho embrya do druhého atd. Tyto metody se také používají ke studiu důsledků zničení (například pomocí laserového paprsku) částí embrya nebo jeho jednotlivých buňky. Transplantace jako druh mikrochirurgie se používá k identifikaci cest buněčné migrace a zdrojů vývoje tkáně. Současně se místo embrya, například křepelky, transplantuje na stejné místo kuřecího embrya místo vzdáleného místa. Jádra křepelčích buněk mají charakteristickou strukturu a jsou proto odlišitelná od jader kuřecích embryonálních buněk.
explantace- excize malé oblasti embrya a jeho kultivace v umělém prostředí. Pomocí této metody je možné získat informace o zdrojích vývoje tkáně z dané oblasti embrya a identifikovat histogenetické vzorce vývoje.
Jaderná transplantace- metoda klonování embryí. Například transplantace jader z buněk střevního epitelu drápatého žabího pulce do žabího vajíčka, jehož jádro bylo inaktivováno ultrafialovým paprskem, vedla ke vzniku nových jedinců (Gerdonovy experimenty). Tyto experimenty položily základ pro klonování vyšších obratlovců a přispěly ke vzniku (v roce 1997) slavné ovce Dolly. Podobné embryologické experimenty přesvědčivě ukázaly, že jádra somatických buněk obsahují kompletní sadu genetických informací pro vývoj nového organismu.
Nejnovější úspěch experimentální embryologie byl vývoj metody mimotělního oplodnění. Transplantace embryí počatých in vitro do dělohy je základem léčby neplodnosti. V roce 1973 L. Shettles (USA) odebral preovulační vajíčko z vaječníku neplodné ženy a oplodnil ho spermiemi jejího manžela. To byl začátek techniky transplantace lidských embryí za účelem léčby neplodnosti. Avšak teprve v roce 1978 ve Velké Británii, v důsledku úspěšné transplantace do dělohy neplodné ženy lidského embrya ve stadiu 8 blastomer, po 2,5 dnech kultivace, první dítě ze zkumavky na světě o hmotnosti Objevilo se 2700 g.