Histologiset tutkimusmenetelmät Niitä käytetään ihmisen, eläinten ja kasvien solujen ja kudosten rakenteen ja toiminnan tutkimiseen normaaleissa, patologisissa ja kokeellisissa olosuhteissa. G. m.:n ja. on - joukko metodologisia tekniikoita, joita käytetään solu- ja kudosvalmisteiden valmistuksessa niiden mikroskooppista tutkimusta varten. Solujen ja kudosten mikroskooppinen tutkimus voidaan suorittaa kahdella päätavalla tutkittavan kohteen tilasta riippuen: elävien solujen ja kudosten tutkimus, elottomien solujen ja kudosten tutkimus, jotka säilyttävät rakenteensa erityisen kiinnityksen vuoksi tekniikat. Elävien esineiden - elintärkeiden (supravital) - tutkiminen mahdollistaa solujen ja kudosten fysiologisten prosessien tarkkailun, niiden intravitaalisen rakenteen. Se suoritetaan soluille, jotka on vapaasti suspendoitu nestemäiseen väliaineeseen (verisolut, raapivien epiteelisolut jne.), sekä solu- ja kudosviljelmillä, jotka on kasvatettu erityisillä ravintoalustoilla. Intravitaalisen havainnoinnin kohteena voivat olla ohuet, läpinäkyvät kudoskalvot (, uimakalvo). Kokeellisissa tutkimuksissa käytetään biologisten ikkunoiden menetelmää (läpinäkyvien kammioiden istutus) ja kudosimplanttien tutkimusta luonnollisessa läpinäkyvässä ympäristössä, esimerkiksi eläinten silmän etukammiossa. Vitaalitutkimuksissa käytetään tehtävästä riippuen erilaisia erityismikroskopiamenetelmiä: tummakenttä, vaihekontrasti, fluoresenssi, polarisaatio, ultravioletti. Elinperäisiä histologisia menetelmiä käytetään pääasiassa biologisessa ja biolääketieteellisessä tutkimuksessa. Niiden laajaa käyttöä rajoittavat suuret tekniset vaikeudet, jotka liittyvät eloonjääneiden kudosten ominaisuuksiin. Lääketieteellisessä tutkimuksessa, erityisesti anatomisen patologian laboratorioiden käytännössä, käytetään kiinteiden esineiden tutkimusmenetelmiä. Kiinnityksen tarkoituksena on säilyttää solujen ja kudosten intravitaalinen rakenne altistamalla ne nopeasti kemiallisille aineille, jotka estävät post mortem -muutosten kehittymisen. Kiinnitysmenetelmän valinta riippuu tutkimuksen tavoitteista ja kiinnitettävän materiaalin ominaisuuksista. Siten ohuiden solurakenteiden tunnistamiseen käytetään raskasmetallien suoloja (esim. sublimaattia) sisältäviä kiinnitysseoksia.Paras kiinnitysaine sytologisiin tarkoituksiin on osmiumtetroksidi, jota käytetään usein elektronimikroskopiassa. Universaali kiinnitysaine on formaldehydi, jota käytetään 10-prosenttisena formaliiniliuoksena. Pehmopaperin palasten tulee olla tasaisia ja täydellisiä, ja kiinnitysnesteen tilavuuden tulee olla monta kertaa suurempi kuin kiinnitettävän materiaalin tilavuus. Kiinnityksen jälkeen palat pestään yleensä vedessä tai alkoholissa. Kiinteät kudoskomponentit (esim. kalsiumjäämät) poistetaan kalkinpoistotekniikoilla. Nopein ja helpoin tapa valmistaa kudosleike, jota yleensä käytetään pikadiagnostiikassa, on pala ja kudosleikkeiden hankkiminen pakastusmikrotomilla. On kuitenkin vaikeaa saada riittävän ohuita leikkeitä, samoin kuin leikkeitä pienistä esineistä ja rappeutuvista kudoksista. Siksi kudospalat kaadetaan yleensä tiivistysaineeseen - tai selloidiiniin. Kiinteä dehydratoidaan vahvuuksilla alkoholeissa, johdetaan väliliuottimen läpi (ksyleeni tai parafiini, alkoholieetteri selloidiinille) ja kyllästetään parafiinilla tai selloidiinilla. parafiinissa voit saada ohuempia osia (5-8 - 1-2 mikronia) kuin selloidiini. Leikkeet mikroskooppista tutkimusta varten valmistetaan käyttämällä objektilasia tai pyörivää mikrotomia. Erittäin ohuet osat (paksuus 90-100 - 5-15 nm), joita tarvitaann, valmistetaan ultratomilla. Ultratomeja käytetään myös valomikroskopiassa puoliohuiden leikkeiden saamiseksi. Valmistetut leikkeet värjätään, jotta värit eri tavalla havaitsevien solujen ja kudosten rakenteet korostuvat selvästi. Pääväriaineet - värjäysemäkset ja niiden suolat (toluidiininsininen, taivaansininen, bismarckin ruskea) - värjäävät niin sanottuja basofiilisiä rakenteita (soluytimiä, sidekudosta). Happamat väriaineet - värjäävät hapot ja niiden suolat (pikriinihappo, erytrosiini) - värjäävät asidofiilisiä tai oksifiilisiä rakenteita (solusytoplasma, kollageeni, elastiset kuidut). värjäys tulisi erottaa kyllästyksellä - erityisellä menetelmällä, joka perustuu tiettyihin solujen ja kudosten alueisiin raskasmetallien (esimerkiksi hopea, kulta, osmium) palauttamiseksi suoloistaan ja siten intensiivisen värin saamiseksi. Histologisen valmisteen valmistelu viimeistellään sijoittamalla se väliaineisiin, jotka varmistavat esineen rakenteiden, värin ja läpinäkyvyyden säilymisen. Useimmiten näihin tarkoituksiin käytetään esimerkiksi orgaanisia hartseja.
1. Pieni lääketieteellinen tietosanakirja. - M.: Lääketieteellinen tietosanakirja. 1991-96 2. Ensiapu. - M.: Suuri venäläinen tietosanakirja. 1994 3. Lääketieteellisten termien tietosanakirja. - M.: Neuvostoliiton tietosanakirja. - 1982-1984.
Katso, mitä "histologiset tutkimusmenetelmät" ovat muissa sanakirjoissa:
Metodiset lähestymistavat ja tutkimusmenetelmät ihmisen anatomiassa- Joskus kuulee, että anatomiassa ei ole enää mitään opiskelua, tutkimusta, oletettavasti kaikki aiheet on käytetty loppuun, kaikki mitä voidaan opiskella, on jo tutkittu, kaikki asiat on ratkaistu. Ikään kuin kaikki, mikä koskee ihmiskehon rakennetta, ... ... Sanasto ihmisen anatomian termeistä ja käsitteistä
LABORATORIOTUTKIMUS- LABORATORIOTUTKIMUS. katso LABORATORIOTUTKIMUKSET. Tärkein edellytys luotettavien tutkimustulosten saamiselle on analyysikohteiden oikea valinta, oikea-aikainen valinta ja tutkimusongelman muotoilu. Näytteenottosäännöt… Kalataudit: käsikirja
I Lääketiede Lääketiede on tieteellisen tiedon ja käytännön järjestelmä, jonka tavoitteena on terveyden vahvistaminen ja ylläpitäminen, ihmisten eliniän pidentäminen sekä ihmisten sairauksien ehkäisy ja hoito. Näiden tehtävien suorittamiseksi M. tutkii rakennetta ja ... ... Lääketieteellinen tietosanakirja
Tapoja tutkia erilaisia esineitä mikroskoopilla. Biologiassa ja lääketieteessä näiden menetelmien avulla voidaan tutkia mikroskooppisten esineiden rakennetta, joiden mitat ovat ihmissilmän resoluution ulkopuolella. M.m.i. muodostaa…… Lääketieteellinen tietosanakirja
- (histologinen cytussolu + kreikkalainen logos -doktriini) perustuu mikroskoopilla tutkimukseen solujen rakenteellisista piirteistä, kudoselinten solukoostumuksesta, ihmisten ja eläinten ruumiinnesteistä normaaleissa ja patologisissa prosesseissa. C. ja......... Lääketieteellinen tietosanakirja
I Histologia (kreikaksi histos kudos + logos-opetus) on biolääketieteen tiede, joka tutkii kudosten kehitystä, niiden kehitystä kehossa (histogeneesi), rakennetta, toimintoja ja vuorovaikutusta monisoluisissa eläimissä ja ihmisissä. Pääasiallinen opiskeluaihe G. ...... Lääketieteellinen tietosanakirja
I Vulva (vulva; pudendum femininum) ulkoiset naisen sukuelimet (kansainvälisen anatomisen nimikkeistön mukaan naisen sukupuolielinten alue). Anatomia ja fysiologia. Häpy (kuva 1) sijaitsee lantion häpyluiden ulkopuolella ja kiinnittyy niihin ... ... Lääketieteellinen tietosanakirja
Erilaisten sairausprosessien elimistössä aiheuttamia muutoksia tutkiessaan se pyrkii luontaisilla tutkimusmenetelmillään selvittämään nämä sairausprosessit ja niiden merkityksen sairauden ja kuoleman kliinisen kuvan suhteen ... ... Ensyklopedinen sanakirja F.A. Brockhaus ja I.A. Efron
I Biopsia (kreikaksi bios life + opsis näkemys, visuaalinen havainto) kudosten, elinten tai solususpensioiden intravitaalinen otto mikroskooppiseen tutkimukseen diagnostisia tarkoituksia varten sekä patologisen prosessin dynamiikan ja vaikutuksen tutkimiseksi ... ... Lääketieteellinen tietosanakirja
Tiede, joka tutkii eläinten kudoksia. Kudos on joukko soluja, jotka ovat samanlaisia muodoltaan, kooltaan ja toiminnaltaan sekä aineenvaihduntatuotteiltaan. Kaikissa kasveissa ja eläimissä, primitiivisimpiä lukuun ottamatta, keho koostuu kudoksista, ... ... Collier Encyclopedia
- (kreikaksi ἱστός kudos ja kreikaksi λόγος tieto, sana, tiede) biologian ala, joka tutkii elävien organismien kudosten rakennetta. Tämä tehdään yleensä leikkaamalla kudos ohuiksi kerroksiksi ja käyttämällä mikrotomia. Toisin kuin anatomia, ... ... Wikipedia
Kirjat
- Multippeli myelooma ja plasmasolutaudit, Ramasami Kartik, Lonial Sagar. Kirja esittelee multippelin myelooman ja muiden plasmasolusairauksien tärkeimmät kliiniset näkökohdat. Laboratoriotutkimukset, patogeneesi, diagnoosi ja hoito kuvataan. Toisessa…
Tutkimuskohteet voivat olla kiinteitä (kuolleita) tai eläviä soluja ja kudoksia.
Raaka-aineiden ja eläintuotteiden mikrorakenteen tutkimiseen käytetään pääsääntöisesti kiinteitä soluja ja kudoksia. Valmisteet ovat väliaikaisia, yhteen tutkimukseen tarkoitettuja ja pysyviä, joita voidaan varastoida ja tutkia toistuvasti. Lisäksi käytetään kokonaisvalmisteita tai kokonaisia valmisteita.
Väliaikaiset huumeet voidaan kypsentää suhteellisen nopeasti; tätä varten tutkittava materiaali kiinnitetään ja leikkeitä saadaan jäädyttävälle mikrotomille, jonka puuttuessa kudoksesta tai elimestä voidaan tehdä ohut leike skalpellilla tai terällä. Tuloksena oleva osa värjätään, asetetaan lasilevylle ja sitten laitetaan pisara glyseriiniä ja peitetään peitinlasilla. Tärkkelyksen havaitsemiseksi käytetään jodin liuosta kaliumjodidissa: 0,5 g kaliumjodidia liuotetaan pieneen määrään vettä, lisätään 1 g kiteistä jodia ja lisätään vettä 100 cm 3:een. Muutama tippa reagenssia levitetään lasilevyllä olevalle ohuelle palalle makkaraa, juustoa ja muuta materiaalia, tärkkelys muuttuu siniviolettiksi.
Kokonaiset tai kokonaiset valmisteet tutkitaan ilman kudoksen tai elimen osaa. Esimerkiksi kalvo ihonalaista kudosta tai murskattu kasvinjuuren valmiste kiinnityksen, pesun ja värjäyksen jälkeen suljetaan objektilasin ja peitinlasin väliin. Yksittäisten rakenneosien tunnistamiseksi ihonalaisen kudoksen tai sileän lihaskudoksen kiinteät ja värjätyt palat poimitaan neulalla lasilevylle - tällaisia valmisteita kutsutaan kynityiksi. Joissakin tapauksissa, esimerkiksi tutkittaessa silmämunan verkkokalvon kalvoa tai nuijapäiden ihoa, kiinnityksen ja pesun jälkeen värjäystä ei suoriteta, koska solut sisältävät orgaanisia sulkeumia (pigmenttiä), joilla on luonnollinen väri.
Histologisen valmisteen valmistusmenetelmä. Pääasiallinen menetelmä kiinnittyneiden solujen ja kudosten tutkimiseksi on histologinen, ts. erityiseen väliaineeseen suljetun värjätyn kudososan tutkimus. Leikkeiden saamiseksi käytetään testimateriaalin kaatamista parafiiniin tai selloidiiniin, mikä mahdollistaa ohuiden osien (5-7 mikronia tai 10-30 mikronia, vastaavasti) nopean leikkeen (40-60 mikronia) valmistuksen, pakastuksen. tekniikkaa käytetään.
Histologisen näytteen valmistuksen päävaiheet ovat: näytteenotto, kiinnitys, pesu, kuivaus, upottaminen parafiiniin tai selloidiiniin, värjäys, peitinlasin alle asettaminen.
Esimerkkivalinta on tehty ottaen huomioon tutkimuksen tarkoitus ja materiaalin rakenne. Näytteen keskikoko ei saa ylittää 2,5-3,0 cm Maksa- ja pernanäytteet otetaan kapselilla. Sydämestä leikataan palaset eteisestä, koska kalvot ovat ohuempia kuin kammioissa ja yhdellä valmisteella voidaan nähdä epikardiun, sydänlihaksen ja endokardiumin topografinen suhde. Munuaisista, imusolmukkeista, lisämunuaisista leikataan elinten osia, jotka menevät syvälle pintaan kohtisuorassa pintaan, jotta aivokuori ja ydin paljastuvat valmisteella. Jos on tarpeen valmistaa valmisteita muuttuneista elimistä, testimateriaalista leikataan paloja vaurioalueen rajalta siten, että vaurion siirtymäalue sisältyy näytteeseen. Luurankolihaksista otetut näytteet tulee leikata siten, että lihassäikeet ovat pitkittäis- ja poikittaisleikkauksilla. Näytteet jauheliha-, raejuusto- ja muista murenemisnäytteistä asetetaan ensin sideharsoon ja sidotaan langalla. On pidettävä mielessä, että rintaonteloa avattaessa keuhkot romahtavat joustavuuden vuoksi ja menettävät ilmavuutensa merkittävästi, joten uutettujen hengityselinten henkitorveen työnnetään lasi- tai kumiputki, jonka läpi ilmaa ruiskutetaan kohtalaisesti . Henkitorveen asetetaan silkkisidonta asetetun putken alapuolelle ja sidotaan kuorma täydelliseen upotukseen. Suolen kiinnittämiseksi kiinnitykseen tarkoitettu osa elimestä sidotaan alustavasti ligatuureilla molemmilta puolilta. Näytteet on varustettu paksuilla paperitarroilla, joissa on näytteenottonumero ja päivämäärä.
kiinnitys, nuo. Luonnollisen (elinikäisen) arkkitehtoniikan säilyttäminen toteutetaan rakenteiden elävän protoplasman siirtämiseksi muuttumattomaan tilaan. Kiinnitysaineiden vaikutus ilmenee siinä, että biofysikaalisten prosessien seurauksena kudoksissa ja elimissä tapahtuu palautumatonta proteiinien hyytymistä. Elimestä otettu kudosnäyte upotetaan kiinnitysaineeseen mahdollisimman pian; materiaalin ja kiinnitysnesteen tilavuuden suhteen tulee olla vähintään 1:9 (kuva 3).
Kiinnitys johtaa jonkin verran tiivistymiseen ja näytteen tilavuuden pienenemiseen. Kiinnitykseen käytetään useimmiten 10-12% formaliinia, etyylialkoholia, asetonia. Osoitetun kiinnitysnesteen pitoisuuden valmistamiseksi laimennetaan 40 % formaliinia vesijohtovedellä. Etyylialkoholia (100 % absoluuttista tai 96 %) käytetään tapauksissa, joissa on tarpeen tunnistaa osissa vesipitoisiin kiinnittimiin (esimerkiksi glykogeeniin) liukenevia aineita. Asetonissa tutkittava materiaali (esimerkiksi aivot) kiinnittyy vain muutaman tunnin ajaksi. Kun tutkittava elin, kuten luukudos, sisältää kalkkia, suoritetaan kalkinpoisto tai kalkkiutuminen. Tätä varten pieni pala luuta lasketaan (on parempi ripustaa se langalle) typpihapon 5-8-prosenttisessa vesiliuoksessa, joka vaihdetaan 2-3 kertaa päivässä. Kalkinpoiston tulos arvioidaan työntämällä ohut neula luuhun: jos vastusta ei ole, kalkinpoisto suoritetaan loppuun. Tällaisen pro-
punoitus suoritetaan liiallisen kiinnitysaineen poistamiseksi, esimerkiksi formaliinilla kiinnittämisen jälkeen pesu suoritetaan juoksevalla vesijohtovedellä.
Kuivuminen suoritetaan materiaalin tiivistämiseksi etyylialkoholissa, jonka pitoisuus kasvaa: 50-70-100. 50 % ja 70 % alkoholin valmistamiseksi 96 % alkoholia laimennetaan tislatulla vedellä. 100-prosenttisen alkoholin valmistamiseksi on tarpeen lämmittää kuparisulfaattia, kunnes se on täysin kuivattu, ja lisätä 96-prosenttista etyylialkoholia kuivattuun valkoiseen jauheeseen. Jokaisessa alkoholipitoisuudessa materiaalia säilytetään 1-24 tuntia kappaleiden koosta, elimen rakenteesta riippuen; 70-prosenttisessa alkoholissa materiaali säilyy useita päiviä.
täyttää suoritetaan sellaisessa väliaineessa, että testinäyte muuttuu kiinteäksi, mikä mahdollistaa ohuiden osien saamisen. Käytä tätä varten parafiinia (kyllästys 1-4 tuntia), selloidiinia (kyllästys kolmen viikon ajan). Rasvojen paljastamisessa ja irtonaisten kudosten ja elinten tutkimuksessa käytetään gelatiiniin kaatamista.
viipaleita vastaanottaa kelkkaan tai pyöriviin mikrotomeihin. Ohuimmat osat (5-7 mikronia) voidaan valmistaa parafiiniin upotetusta materiaalista. Selloidiinilla täytetystä materiaalista valmistetaan 15-20 mikronin paksuisia leikkeitä. Raaka-aineiden ja eläinperäisten tuotteiden mikrorakenteen tutkimiseen käytetään pääsääntöisesti pakastustekniikkaa. Tämä nopeuttaa valmisteen valmistusta, koska pitkät kuivumis- ja kaatovaiheet jäävät pois. Kiinnityksen ja pesun jälkeen esineen palat asetetaan pakastusmikrotomin märkätasolle ja niistä saadaan 40-60 μm paksuisia leikkeitä. Leikkeet siirretään siveltimellä veteen, jossa ne suoristuvat ja saavat ulkonäön ohuimmiksi harmahtaviksi paloiksi.
Leikkauksen värjäys tehdään eri rakenteiden kontrastin lisäämiseksi valomikroskoopilla tutkittavaksi tarkoitetuissa valmisteissa. Värjäysprosessissa tapahtuu monimutkaisia kemiallisia ja fysikaalisia prosesseja, joten menetelmää valittaessa otetaan huomioon solurakenteiden selektiivinen affiniteetti tiettyihin väriaineisiin, joilla on erilaiset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet.
On olemassa emäksisiä (perusvärejä), happamia ja erikoisvärejä. Perusväreillä värjättyjä rakenteita kutsutaan basofiilinen, happamat väriaineet - oksofiilinen, asidofiilinen, eosinofiilinen.
Perusväreistä (perus)väreistä käytetään hematoksyliiniä, joka värjää ytimen kromatiinin ja muut proteiinia sisältävät rakenteet siniseksi tai purppuraiseksi; karmiini, värjäys ytimen vaaleanpunaiseksi, safraniini - tummanpunainen maali, tioniini - sininen maali.
Happamista väriaineista käytetään eosiinia (värjää sytoplasman vaaleanpunaiseksi), pikriinihappoa (keltainen), fuksiinia (tiilen väri), indigokarmiinia (sininen).
Raaka-aineiden ja kotieläintuotteiden mikrorakennetta tutkittaessa käytetään useimmiten yhdistettyä värjäystä hematoksyliinilla ja eosiinilla. Tätä varten vedestä saadut leikkeet siirretään 1-3 minuutiksi hematoksyliiniliuokseen; Pestään vedessä 20-30 minuuttia, laitetaan eosiiniliuokseen 3-5 minuutiksi ja pestään vedellä 3-5 minuutiksi. Jäljelle jäänyt vesi poistetaan suodatinpaperilla, pisara 96-prosenttista etanolia lisätään 1-2 minuutin ajaksi ja dehydratoidaan 25-prosenttisessa karbolihapon ksyleeni- tai tolueeniliuoksessa. Sitten 1-2 tippaa balsamia levitetään leikkauskohtaan ja peitetään peitinlasilla.
Rasvasulkeumia värjäävistä väreistä käytetään usein Sudan 111. Väriliuoksen valmistamiseksi 95 cm 3 85-prosenttista etyylialkoholia lisätään 5 cm 3 asetonia ja Sudan III -jauhetta kaadetaan, kunnes saadaan kylläinen liuos ( väriainetta on oltava ylimäärä). Seos kuumennetaan 50 % C:seen ja suodatetaan. Pakastemikrotomilla saadut leikkeet asetetaan 50 % etanoliin 1-2 minuutiksi ja sitten Sudan III:aan 25 minuutiksi. Leikkeet huuhdellaan 50 % alkoholilla, pestään tislatulla vedellä ja upotetaan glyseroligelatiiniin.
Neutraalirasvapisarat muuttuvat oransseiksi Sudan III:n liukenemisen rasvojen vuoksi. Rasvasulkeumat voidaan havaita myös osmihapolla, kun taas rasvarakenteet värjätään mustaksi.
Päätelmä kansilasin alla suoritetaan ympäristöissä, jotka eivät päästä ilmaa läpi ja pystyvät pitämään leikkauksen pitkään. Värjätty osat dehydratoidaan vahvemmissa alkoholeissa ja asetetaan peitinlasin alle kuuseen, Kanadan balsamiin tai glyseroligelatiiniin (valmiste ei saa joutua kosketuksiin alkoholien ja ksyleenin kanssa).
Näytteiden valmistelu elektronimikroskopiaa varten. Biologisten objektien tutkimiseen käytetään kahden tyyppisiä elektronimikroskooppeja: lähetys (transmissio) ja pyyhkäisy (rasteri).
Trtutkittavan kohteen käsittelyn periaate perustuu samoihin periaatteisiin kuin optisissa mikroskoopeissa: näytteenotto, kiinnitys, pesu, kuivaus, kaataminen, ultraohuiden osien valmistus, kontrastointi.
Esimerkkivalinta suoritetaan ottaen huomioon tutkimuksen tarkoitus ja materiaalin rakenne samojen sääntöjen mukaisesti kuin valomikroskopiassa. Tutkittavan materiaalin kappaleiden tilavuus ei saa ylittää 1 mm 3 . Kiinnityksen päätarkoitus on pitää kudos mahdollisimman lähellä elämää.
Kiinnitys Se suoritetaan rakenteiden paremman säilymisen vuoksi, joten on tarpeen käyttää reagensseja, joilla on tietty pH ja isotonisuus, joiden arvot määräytyvät kiinnitettävän kudoksen tyypin mukaan. Kiinnitysprosessi suoritetaan kahdessa vaiheessa: prefiksaatio ja jälkikiinnitys. Esifiksaatioon käytetään 2,5-3-prosenttista glutaraldehydiliuosta (pH 7,2-7,4), kiinnityksen kesto 2-4 tuntia Jälkifiksaatio suoritetaan 2-prosenttisessa liuoksessa (pH 7,2-7,4) - 1- 2 tuntia Intravitaalisen rakenteen säilyttämiseksi on suositeltavaa käyttää matalan lämpötilan kiinnitysainetta (0-4 °C) ja valmistaa kiinnitysaineet fosfaattipuskuri-, kakodylaatti-, veronaali-asetaattiliuoksille.
punoitus se suoritetaan 30-prosenttisella kylmällä alkoholilla 5-7 kertaa, esinettä pidetään jokaisessa alkoholiannoksessa 30 minuuttia, ts. pestään kiinnitysaineesta sellaiseen tilaan, kun kiinnitysaineen hapettava vaikutus lakkaa.
Kuivuminen suoritetaan etyylialkoholeilla, joiden vahvuus on kasvanut: 30, 50, 70, 96, 100 % 30 minuutin ajan. Joissakin kaatomenetelmissä suositellaan asetonin ja propyleenioksidin lisäämistä vedenpoistoon.
täyttää suoritetaan epoksihartseissa (araldiitti, epon jne.). Hartsien polymerointi kapseleissa suoritetaan termostaatissa 60 °C:ssa, kunnes se kovettuu yleensä 1-2 päivän kuluessa.
Ultraohuet osat saadaan käyttämällä lasiveitsiä ultramikrotomissa; tätä varten epoksilohkot teroitetaan tetraedrisen katkaistun pyramidin muodossa. Sarja harmahtavat osat asetetaan kylpyyn, jossa on 10 % etanolia. Tuloksena olevat osat asennetaan kupari- tai palladiumverkkoihin, joiden pinnalle levitetään alustavasti formvar-kalvo. Tarvittavien rakenteiden paljastamiseksi verkkojen osat käsitellään lyijysitraatin ja uranyyliasetaatin liuoksilla.
varten pyyhkäisy elektronimikroskopia testinäyte kiinnitetään, dehydratoidaan tutkimuksen tarkoituksesta riippuen käyttämällä yllä olevia kiinnitysaineita. Kuivauksen jälkeen näyte liimataan pidikeesineeseen, asetetaan sputterointiyksikköön ja päällystetään erittäin ohuella kulta- tai platinakerroksella. Toisin kuinsa, pyyhkäisyelektronimikroskoopissa voidaan käyttää syövyttäviä valmisteita: tutkimuskohteeseen kaadetaan joitain kovettuvia aineita, minkä jälkeen valut ja pinnat tutkitaan. He myös tutkivat jäljennöksiä, jotka on saatu jäädyttämällä - hakettamalla. Tässä tapauksessa tutkitaan jäljennöstä esineen pinnan halkeamisesta. Kontrastin lisäämiseksi kopiot on varjostettava ruiskuttamalla metallihiukkasia (kulta, platina) tai hiiltä.
testikysymykset
- 1. Mitä menetelmiä käytetään solurakenteiden, kudosten ja elinten tutkimuksessa?
- 2. Mitä perussääntöjä on noudatettava otettaessa näytteitä histologisten valmisteiden valmistusta varten?
- 3. Mitä ominaisuuksia luukudoksesta valmistettujen valmisteiden valmistuksessa on?
- 4. Miten testimateriaali kiinnitetään?
- 5. Mitä käytetään valmisteiden kuivaamiseen?
- 6. Millä väliaineilla testimateriaalia kaadetaan?
- 7. Mitä väriainetta käytetään rasvakudoksen havaitsemiseen?
- 8. Mikä on yleisimmin käytetty leikkausmenetelmä ja miksi?
- 9. Nimeä näytteiden valmistelun päävaiheet lähetys- ja pyyhkäisyelektronimikroskoopia varten.
Histologia - ("gistos" kreikaksi - kudos, logis - opetus) Tämä on tiede monisoluisten organismien ja ihmisten kudosten rakenteesta, kehityksestä ja elintärkeästä toiminnasta. Tämän tieteen kohteena olevat esineet ovat paljain silmin ulottumattomissa. Siksi histologian historia liittyy läheisesti sellaisten instrumenttien luomisen historiaan, joiden avulla voimme tutkia pienimpiä esineitä paljaalla silmällä. 2
Histologian kurssi on perinteisesti jaettu seuraaviin osiin: n 1. Sytologia on solutiede. n 2. Embryologia on kehitystiede organismin syntymästä täydelliseen muodostumiseen. n 3. Yleinen histologia - tiede kudoksille ominaisista yleisistä kuvioista. n 4. Yksityinen histologia - tutkii elinten ja järjestelmien rakennetta, kehitystä.
SYTOLOGIA - (kreikaksi κύτος "solu" ja λόγος - "tutkimus", "tiede") n Biologian ala, joka tutkii eläviä soluja, niiden organelleja, niiden rakennetta, toimintaa, solujen lisääntymisprosesseja, ikääntymistä ja kuolemaa. neljä
EMBRIOLOGIA n (toisesta -kreikaksi ἔμβρυον - alkio, alkio + -λογία sanasta λόγος - opetus) on tiede, joka tutkii alkion kehitystä. 5
Soluteorian luomisen historia 1590. Jansen keksi mikroskoopin, jossa suurennus saatiin aikaan yhdistämällä kaksi linssiä. 1665. Robert Hooke käytti ensin termiä solu. 1650-1700 vuotta. Anthony van Leeuwenhoek kuvasi ensin bakteereja ja muita mikro-organismeja. 1700-1800 vuotta. Useita uusia kuvauksia ja piirustuksia eri kudoksista, pääasiassa kasviksista, on julkaistu. Vuonna 1827 Karl Baer löysi munan nisäkkäistä. 1831-1833 vuotta. Robert Brown kuvasi ytimen kasvisoluissa. 1838-1839 vuotta. Kasvitieteilijä Matthias Schleiden ja eläintieteilijä Theodor Schwann yhdistivät eri tutkijoiden ajatuksia ja muotoilivat soluteorian, jonka mukaan elävien organismien rakenteen ja toiminnan perusyksikkö on solu. 1855 Rudolf Virchow osoitti, että kaikki solut muodostuvat solujen jakautumisen seurauksena.
Soluteorian luomisen historia 1665. Englantilainen tiedemies, fyysikko Robert Hooke tutki mikroskoopilla korkkileikkaa, joka havaitsi, että se koostuu väliseinillä erotetuista soluista. Näitä soluja hän kutsui "soluiksi"
Soluteorian syntyhistoria 1600-luvulla Leeuwenhoek suunnitteli mikroskoopin ja avasi ihmisille oven mikrokosmukseen. Hämmästyneiden tutkijoiden silmien edessä välähti monenlaisia ripsiä, rotiferejä ja muita pieniä eläviä olentoja. Kävi ilmi, että niitä on kaikkialla - näitä pienimpiä organismeja: vedessä, lannassa, ilmassa ja pölyssä, maassa ja vesikouruissa, mätänevässä eläin- ja kasviperäisessä jätteessä.
Soluteorian luomisen historia 1831-1833. Robert Brown kuvasi ytimen kasvisoluissa. Vuonna 1838 saksalainen kasvitieteilijä M. Schleiden kiinnitti huomion ytimeen ja piti sitä solun alkulähteenä. Schleidenin mukaan ydin tiivistyy rakeisesta aineesta, jonka ympärille muodostuu ydin, ja ytimen ympärille - solu, ja ydin voi kadota solun muodostumisprosessissa.
Soluteorian luomisen historia Saksalainen eläintieteilijä T. Schwann osoitti, että myös eläinkudokset koostuvat soluista. Hän loi teorian, jonka mukaan ytimiä sisältävät solut edustavat kaiken elävän rakenteellista ja toiminnallista perustaa. Solujen rakenneteorian muotoili ja julkaisi T. Schwann vuonna 1839. Sen olemus voidaan ilmaista seuraavilla säännöksillä: 1. Solu on kaikkien elävien olentojen rakenteen perusrakenneyksikkö; 2. Kasvien ja eläinten solut ovat itsenäisiä, homologisia keskenään alkuperältään ja rakenteeltaan. Jokainen solu toimii itsenäisesti muista, mutta yhdessä kaikkien kanssa. 3. Kaikki solut syntyvät rakenteettomasta solujen välisestä aineesta. (Virhe!) 4. Kuori määrää solun elämäntoiminnan. (Virhe!)
Soluteorian syntyhistoria Vuonna 1855 saksalainen lääkäri R. Virchow teki yleistyksen: solu voi syntyä vain edellisestä solusta. Tämä johti sen tosiasian ymmärtämiseen, että organismien kasvu ja kehitys liittyvät solujen jakautumiseen ja niiden erilaistumiseen edelleen, mikä johtaa kudosten ja elinten muodostumiseen.
Karl Baerin soluteorian luomisen historia Vuonna 1827 Karl Baer löysi munan nisäkkäistä ja osoitti, että nisäkkäiden kehitys alkaa hedelmöitetystä munasta. Tämä tarkoittaa, että minkä tahansa organismin kehitys alkaa yhdestä hedelmöitetystä munasolusta, solu on kehitysyksikkö.
Soluteorian syntyhistoria 1865 Perinnöllisyyden lait julkaistiin (G. Mendel). 1868 Nukleiinihapot löydettiin (F. Miescher) 1873 Kromosomit löydettiin (F. Schneider) 1874 Mitoosi löydettiin kasvisoluista (I. D. Chistyakov) 1878 Eläinsolujen mitoottinen jakautuminen löydettiin (W. Fleming, P. I. Peremezhko) 187 Fleming - kromosomien käyttäytyminen jakautumisen aikana. 1882 Meioosi löydettiin eläinsoluista (W. Fleming) 1883 Osoitettiin, että kromosomien määrä sukusoluissa on kaksi kertaa pienempi kuin somaattisissa soluissa (E. Van Beneden) 1887 Meioosi havaittiin kasvisoluista (E. Strasburger) 1898 Golgi löysi solun verkkolaitteen, Golgi-laitteen. 1914 Kromosomiteoria perinnöllisyydestä muotoiltiin (T. Morgan). 1924 Luonnontieteellinen teoria elämän syntymisestä maapallolla julkaistiin (A. I. Oparin). 1953 Muotoiltiin ideoita DNA:n rakenteesta ja luotiin sen malli (D. Watson ja F. Crick). 1961 Geneettisen koodin luonne ja ominaisuudet määritetään (F. Crick, L. Barnet, S. Benner).
Nykyaikaisen soluteorian päämääräykset 1. Solu on elävä alkeisjärjestelmä, eliöiden rakenteen, elintoiminnan, lisääntymisen ja yksilöllisen kehityksen yksikkö. 2. Kaikkien elävien organismien solut ovat homologisia, rakenteeltaan ja alkuperältään yhtenäisiä. 3. Solujen muodostuminen. Uusia soluja syntyy vain jakamalla olemassa olevia soluja. 4. Solu ja organismi. Solu voi olla itsenäinen organismi (prokaryootit ja yksisoluiset eukaryootit). Kaikki monisoluiset organismit koostuvat soluista. 5. Solujen toiminnot. Soluissa tapahtuu aineenvaihduntaa, ärtyneisyyttä ja kiihtyneisyyttä, liikettä, lisääntymistä ja erilaistumista. 6. Solujen evoluutio. Soluorganisaatio syntyi elämän kynnyksellä ja kulki pitkän evoluution kehityksen ytimettömistä muodoista (prokaryootit) ydinmuotoihin (eukaryootit).
HISTOLOGISTEN NÄYTTEIDEN MIKROSKOPIOINTIMENETELMÄT 1. Valomikroskopia. 2. Ultraviolettimikroskopia. 3. Fluoresoiva (luminesoiva) mikroskopia. 4. Faasikontrastimikroskopia. 5. Pimeäkenttämikroskopia. 6. Interferenssimikroskopia 7. Polarisaatiomikroskopia. 8. Elektronimikroskopia. 17
Mikroskooppi n Tämän optisen laitteen avulla voit tarkkailla pieniä esineitä. Kuvan suurennus saadaan aikaan objektiivilinssien ja okulaarijärjestelmän avulla. Peili, lauhdutin ja kalvo ohjaavat valovirtaa ja säätelevät kohteen valaistusta. Mikroskoopin mekaaninen osa sisältää: kolmijalan, esinepöydän, makro- ja mikrometriruuvit, putken pidikkeen. kahdeksantoista
Erityiset mikroskopiamenetelmät: - vaihekontrastimikroskooppi - (elävien värjäytymättömien esineiden tutkimiseen) - mikroskoopin avulla voit tutkia eläviä ja värjäytymättömiä esineitä. Kun valo kulkee värillisten esineiden läpi, valoaallon amplitudi muuttuu ja kun valo kulkee värittämättömien esineiden läpi, valoaallon vaihe muuttuu, jota käytetään korkeakontrastisen kuvan saamiseksi vaihekontrasti- ja interferenssimikroskoopissa. - tummakenttämikroskooppi (elävien tahraamattomien esineiden tutkimiseen). Käytetään erityistä lauhdutinta, joka korostaa maalaamattoman materiaalin kontrastisia rakenteita. Pimeäkenttämikroskopia mahdollistaa elävien esineiden tarkkailun. Havaittu kohde näyttää valaistulta pimeässä kentässä. Tässä tapauksessa valaisimen säteet putoavat esineeseen sivulta, ja vain hajallaan olevat säteet tulevat mikroskoopin linsseihin. 19
Erikoismikroskoopin menetelmät Luminescent mic-p (elävien värjäytymättömien esineiden tutkimiseen) Mikroskopiaa käytetään fluoresoivien (luminesoivien) esineiden tarkkailuun. Fluoresoivassa mikroskoopissa voimakkaasta lähteestä tuleva valo kulkee kahden suodattimen läpi. Yksi suodatin estää valon näytteen edessä ja sallii näytteen virittävän aallonpituuden valon fluoresoida. Toinen suodatin päästää läpi fluoresoivan kohteen lähettämän aallonpituuden valon. Siten fluoresoivat esineet absorboivat yhden aallonpituuden valoa ja lähettävät valoa spektrin toisella alueella. -ultraviolettikyky m-pa) mic-p (lisää resoluutiota -polarisaatio mic-p (tutkimuskohteille, joissa molekyylit ovat järjestyksessä - luuranko, lihas, kollageenisäikeet jne.) mikroskopia - värittömien anisotrooppisten rakenteiden kuvanmuodostus (esim. kollageenikuituina ja myofibrilleinä).20
Erityiset mikroskopiamenetelmät - interferenssimikroskooppi (soluissa olevan kuivan jäännöksen määrittämiseksi, esineiden paksuuden määrittämiseksi) - mikroskoopissa yhdistyvät faasikontrasti- ja polarisaatiomikroskoopin periaatteet ja sitä käytetään kontrastikuvan saamiseksi värjäytymättömistä esineistä. Erityinen häiriöoptiikka (Nomarsky-optiikka) on löytänyt sovelluksen mikroskoopeissa, joissa on differentiaalinen häiriökontrasti. C. Elektronimikroskopia: -transmissio (objektien tutkiminen lähetyksen kautta) -pyyhkäisy (esineiden pinnan tutkimus) Teoreettisesti transmissio-EM:n resoluutio on 0,002 nm. Nykyaikaisten mikroskooppien todellinen resoluutio lähestyy 0,1 nm. Biologisille kohteille EM-resoluutio on käytännössä 2 nm. 21
Erikoismikroskooppitekniikat Transmissioelektronimikroskooppi koostuu pylväästä, jonka läpi katodifilamentin emittoimat elektronit kulkevat tyhjiössä. Rengasmagneettien fokusoima elektronisäde kulkee valmistetun näytteen läpi. Elektronien sironnan luonne riippuu näytteen tiheydestä. Näytteen läpi kulkevat elektronit fokusoidaan, tarkkaillaan fluoresoivalla näytöllä ja tallennetaan valokuvauslevyllä. Pyyhkäisyelektronimikroskoopilla saadaan kolmiulotteinen kuva tutkittavan kohteen pinnasta. Chip-menetelmällä (jäädytys-leikkaus) tutkitaan solukalvojen sisäistä rakennetta. Solut jäädytetään nestemäisen typen lämpötilassa kylmältä suojaavan aineen läsnä ollessa ja niitä käytetään lastujen valmistukseen. Pilkkomistasot kulkevat lipidikaksoiskerroksen hydrofobisen keskiosan läpi. Kalvojen paljastettu sisäpinta varjostetaan platinalla, tuloksena saatuja kopioita tutkitaan skannaavassa EM:ssä. 22
Erityiset (ei-mikroskooppiset) menetelmät: 1. Syto- tai histokemia - ydin on tiukasti spesifisten kemiallisten reaktioiden käyttö kevyen lopputuotteen kanssa soluissa ja kudoksissa erilaisten aineiden (proteiinit, entsyymit, rasvat, hiilihydraatit, jne.). Voidaan käyttää valo- tai elektronimikroskoopin tasolla. 2. Sytofotometria - menetelmää käytetään yhdessä 1:n kanssa ja se mahdollistaa sytohistokemiallisella menetelmällä tunnistettujen proteiinien, entsyymien jne. kvantifioinnin 3. Autoradiografia - kemiallisten alkuaineiden radioaktiivisia isotooppeja sisältäviä aineita viedään kehoon. Nämä aineet sisältyvät solujen aineenvaihduntaprosesseihin. Näiden aineiden lokalisointi ja liikkuminen elimissä määritetään histologisista valmisteista säteilyllä, joka vangitaan valmisteelle levitetyllä valokuvaemulsiolla. 4. Röntgendiffraktioanalyysi - voit määrittää solujen kemiallisten alkuaineiden määrän, tutkia biologisten mikroobjektien molekyylirakennetta. 24 5. Morfometria - biol. rakenteita solu- ja subsellulaarisella tasolla.
Erityiset (ei-mikroskooppiset) menetelmät 6. Mikrourgia - erittäin herkkien toimenpiteiden suorittaminen mikromanipulaattorilla mikroskoopin alla (ydinsiirto, erilaisten aineiden vieminen soluihin, biopotentiaalien mittaus jne.) 6. Solujen ja kudosten viljelymenetelmä - in ravintoaineväliaineisiin tai diffuusiokammioihin istutettuna eri kehon kudoksiin. 7. Ultrasentrifugointi - solujen tai subsellulaaristen rakenteiden fraktiointi sentrifugoimalla eri tiheyksissä olevissa liuoksissa. 8. Kokeellinen menetelmä. 9. Kudos- ja elinsiirtomenetelmä. 25
Kiinnitys säilyttää solujen, kudosten ja elinten rakenteen, estää niiden bakteerikontaminaation ja entsymaattisen hajoamisen sekä stabiloi makromolekyylejä niiden kemiallisen silloittumisen kautta. 32
Kiinnittävä nestemäinen formaliini, alkoholit, glutaraldehydi - Yleisimmät kiinnitysaineet; Kryofiksaatio - Rakenteiden paras säilyvyys varmistetaan näytteen välittömällä jäädytyksellä nestetypessä (-196 °C); Lyofilisointi - pienet kudospalat jäädytetään nopeasti, mikä pysäyttää aineenvaihduntaprosessit. Dehydratointi - tavallinen vedenpoistomenettely on dehydraatio alkoholissa, jonka vahvuus on kasvanut (70 - 60 %). Täyte - tekee kankaasta kestävän, estää sitä murskaamasta ja rypistymästä leikkauksen aikana, mahdollistaa vakiopaksuisten leikkausten tekemisen. Yleisin upotusväline on parafiini. Myös selloidiinia, muovia ja hartseja käytetään. 33
Kuivuminen valmistaa kiinteän kudoksen tunkeutumaan upotusväliaineeseen. Vesi elävästä kudoksesta sekä vesi kiinnitysseoksista (useimmat kiinnitysaineet ovat vesiliuoksia) on poistettava kokonaan kiinnityksen jälkeen. Vakiomenetelmä veden poistamiseksi on dehydraatio alkoholissa, jonka vahvuus nousee 60°:sta 100°:een. 34
Täyttö on välttämätön toimenpide, joka edeltää osien valmistelua. Täyte tekee kankaasta kestävän, estää sen murskaantumisen ja rypistymisen leikkauksen aikana ja mahdollistaa ohuiden vakiopaksuisten osien saamisen. Yleisin upotusväline on parafiini. Myös selloidiinia, muovia ja hartseja käytetään. 35
Pyörivä mikrotomi. 40 n Elukappaleen sisältävät kappaleet kiinnitetään liikkuvaan esinepidikkeeseen. Kun se lasketaan alas, sarjaosat jäävät veitseen, ne poistetaan veitsestä ja kiinnitetään lasilevylle jatkokäsittelyä ja mikroskopiaa varten.
Histoseektiovärjäysmenetelmät: n Tuma (emäksinen): n hematoksyliini - värjäytyy n n n n ytimet siniseksi; rauta hematoksyliini; azur II (violetti); karmiini (punainen); safraniini (punainen); metyylisininen (siniseen); toluidiini (sininen); tioniini (sininen). n Sytoplasma- (happo): n eosiini - vaaleanpunainen; n erytrosiini; n oranssi "G" ; n hapan fuksiini - punaiseksi; n pikriinihappo - keltainen; n Kongo - punainen - punaiseen 44
ERITYISET menetelmät histosektioiden värjäykseen n Sudan III – lipidien ja rasvojen oranssivärjäys; n osmihappo - lipidien ja rasvojen värjäys mustaksi; n orcein - elastisten kuitujen ruskea väritys; n hopeanitraatti - hermoelementtien kyllästäminen tummanruskealla värillä. 45
Solurakenteet: n OXYFILIA n kyky värjätä vaaleanpunaiseksi happamilla väriaineilla n basofiilinen kyky värjätä siniseksi emäksisillä väreillä n neutrofiilia - kyky värjätä violetiksi happamilla ja emäksisillä väriaineilla. 47
1
Solu n on elävä alkeisjärjestelmä, joka koostuu sytoplasmasta, ytimestä, kalvosta ja on perusta eläin- ja kasviorganismien kehitykselle, rakenteelle ja elämälle.
Glykokaliksi on epimembraanikompleksi, joka koostuu proteiineihin sitoutuneista sakkarideista ja lipideihin sitoutuneista sakkarideista. Toiminnot n Vastaanotto (hormonit, sytokiinit, välittäjät ja antigeenit) n solujen välinen vuorovaikutus (ärtyvyys ja tunnistaminen) n parietaalinen ruoansulatus (suolen rajasolujen mikrovillit)
Sytolemman toiminnot: - rajaava; - aineiden aktiivinen ja passiivinen kuljetus molempiin suuntiin; - reseptoritoiminnot; yhteyttä naapurisoluihin.
Main Tutkimuskohteet ovat histologisia valmisteita, ja pääasiallinen tutkimusmenetelmä on mikroskopia.
Histologisen valmisteen tulee olla riittävän läpinäkyvä (ohut) ja kontrasti. Se on valmistettu sekä elävistä että kuolleista (kiinteistä) rakenteista. Valmiste voi olla solususpensio, sively, painatus, kalvo, kokonaisvalmiste ja ohut leike.
Histologisten valmisteiden valmistusprosessi mikroskooppisia tutkimuksia varten sisältää seuraavat päävaiheet: 1) materiaalin ottaminen ja kiinnittäminen; 2) materiaalin tiivistäminen; 3) osien valmistelu; 4) värjäys tai kontrastileikkaukset; 5) osioiden päättäminen.
Värjäykseen käytetään erityisiä histologisia väriaineita, joiden pH-arvot vaihtelevat: hapan, neutraali ja emäksinen. Niiden värjäämiä rakenteita kutsutaan vastaavasti oksifiilisiksi, neutrofiilisiksi (heterofiilisiksi) ja basofiilisiksi.
Mitä menetelmiä histologinen tiede käyttää? Niitä on melko paljon ja erilaisia:
Mikroskooppi.
Valomikroskopia. Nykyaikaisissa mikroskoopeissa on korkea resoluutio. Resoluutio määritellään pienimmäksi etäisyydeksi (d) kahden vierekkäisen pisteen välillä, jotka voidaan nähdä erikseen. Tämä etäisyys riippuu valon aallonpituudesta (λ) ja ilmaistaan kaavalla: d = 1/2 λ.
Spektrin näkyvän osan minimiaallonpituus on 0,4 µm. Siksi valomikroskoopin erotuskyky on 0,2 µm ja kokonaissuurennus saavuttaa 2500-kertaisen.
ultraviolettimikroskopia . Ultraviolettivalon aallonpituus on 0,2 µm, joten ultraviolettimikroskoopin resoluutio on 0,1 µm, mutta koska ultraviolettisäteily on näkymätöntä, tarvitaan luminesoiva näyttö tutkittavan kohteen tarkkailuun.
Fluoresoiva (luminesoiva) mikroskopia. Lyhytaaltoinen (näkymätön) säteily, joka absorboituu useisiin aineisiin, kiihottaa niiden elektroneja, jotka lähettävät valoa pidemmällä aallonpituudella, ja niistä tulee spektrin näkyvä osa. Siten saavutetaan mikroskoopin resoluution kasvu.
Faasikontrastimikroskopia voit lähettää värittömiä esineitä.
Polarisoiva mikroskopia käytetään histologisten rakenteiden, kuten kollageenikuitujen, arkkitehtoniikan tutkimiseen.
elektronimikroskopia mahdollistaa kymmeniä tuhansia kertoja suurennettujen esineiden tutkimisen.
Mikrovalokuvaus ja mikrofilmografia . Nämä menetelmät mahdollistavat valokuvien kiinteiden esineiden ja liikkuvien elävien mikroskooppisten esineiden tutkimisen.
Kvalitatiivisen ja kvantitatiivisen tutkimuksen menetelmät.
Histo –ja sytokemia , mukaan lukien kvantitatiivinen, mahdollistaa tutkittavien kohteiden kvalitatiivisen analyysin kudos-, solu- ja subsellulaarisella tasolla.
Sytospektrofotometria Se mahdollistaa tiettyjen biologisten aineiden kvantitatiivisen sisällön tutkimisen soluissa ja kudoksissa perustuen niihin liittyvän väriaineen tietyn aallonpituuden valon absorptioon.
Differentiaalinen sentrifugointi avulla voit erottaa solujen sisällöt, jotka eroavat toisistaan massaltaan.
Radiografia Se perustuu radioaktiivisen leiman (esimerkiksi radioaktiivisen jodin, H³-tymidiinin jne.) sisällyttämiseen aineenvaihduntaprosessiin.
Morfometria mahdollistaa solujen, niiden ytimien ja organellien pinta-alojen ja tilavuuksien mittaamisen okulaari- ja objektimikrometreillä ja erikoisruudukoilla.
Tietokonesovellus digitaalisen materiaalin automaattiseen käsittelyyn.
Kudosviljelymenetelmä on solujen ja kudosten elinkyvyn ja jakautumisen ylläpitäminen kehon ulkopuolella. Tätä varten käytetään erityisiä ravintoainesäiliöitä, joissa luodaan kaikki tarvittavat olosuhteet solujen elintärkeälle aktiivisuudelle. Tällä menetelmällä voidaan tutkia solujen erilaistumista ja toiminnallista kehitystä, niiden pahanlaatuisen transformaation ja kasvainprosessin kehittymisen malleja, solujen välistä vuorovaikutusta, virusten ja mikro-organismien aiheuttamia solu- ja kudosvaurioita, lääkkeiden vaikutusta aineenvaihduntaan. prosessit soluissa ja kudoksissa jne.
Intravitaalinen (vitaali) värjäys käytetään fagosytoosi-ilmiöiden ja makrofagien toiminnan, munuaisten tubulusten suodatuskyvyn jne. tutkimiseen.
Kudossiirtomenetelmä. Tällä menetelmällä tutkitaan solujen käyttäytymistä ja niiden morfofunktionaalista tilaa, kun ne siirretään toiseen organismiin. Tätä menetelmää käytetään esimerkiksi pitämään eläimiä alttiina tappaville säteilyannoksille.
Mikromanipulaatio. Tätä menetelmää on käytetty molekyylibiologiassa, geenitekniikassa ja myös kloonauksessa, kun munasta poistetaan tuma haploidisella kromosomijoukolla mikromanipulaattorilla ja siihen siirretään somaattinen solun ydin, jossa on diploidinen kromosomisarja.
Olemassa monia tutkimusmenetelmiä, joista seuraavat erottuvat: elävien alkioiden havainnointi elokuva- ja videotallenteella (käytetään pääasiassa kokeessa). Tätä varten käytetään erityistä mikrovalokuvalaitetta, joka on kytketty lämpökammioon, jossa alkio kehittyy. Kun tutkit esimerkiksi kanan alkion kehitystä, teet kuoreen ikkunan, joka suljetaan läpinäkyvällä levyllä. Tämä menetelmä mahdollisti alkioiden muodon ja koon muutosten dynamiikan jäljittämisen ja tarkentamisen kehitysprosessissa.
Kiinteä leikkausmenetelmä alkiot valo- ja elektronimikroskopiaa, historadioautografiaa, histo- ja immunosytokemiaa käyttäen. Nämä menetelmät mahdollistavat kudosten ja solunsisäisten muutosten analysoinnin alkion osien kehitysdynamiikassa. Histo- ja immunosytokemiallisten menetelmien avulla tutkitaan alkiosoluissa tapahtuvia biokemiallisia prosesseja - DNA:n, RNA:n, proteiinien, spesifisten reseptoriproteiinien jne. synteesiä. Näiden menetelmien avulla saatiin tärkeää tietoa solujen ja kudosten erilaistumisesta kehityksessä. alkioista ja sikiöistä.
Merkintämenetelmä, jonka W. Vogt (1888-1941) ehdotti vuonna 1925, mahdollistaa soluliikkeiden tutkimisen kehittyvässä alkiossa. Tätä varten käytetään merkkejä, jotka eivät ole myrkyllisiä alkiolle (esimerkiksi neutraali punainen, hiilihiukkaset), sekä vasta-aineita tietyille proteiineille. Vasta-aineita käytettäessä hyödynnetään niiden kykyä yhdistyä fluoresoivan väriaineen ja alkioproteiinien kanssa. Fluoresenssimikroskopian avulla seurataan väriaineen jakautumista ja tutkitaan proteiinisynteesin dynamiikkaa alkion kehittyvissä kudoksissa.
Mikrokirurgiset menetelmät kehittivät 1900-luvun alussa G. Spemannin koulukunnan (1869-1941) edustajat. Niihin kuuluivat: eläimen munien kuorien poistaminen, alkion osien siirtäminen toiseen jne. Näitä menetelmiä käytetään myös alkion osien tai sen yksilön tuhoutumisen (esimerkiksi lasersäteen avulla) seurausten tutkimiseen. soluja. Transplantaatiota eräänlaisena mikrokirurgiana käytetään tunnistamaan solujen migraatioreittejä ja kudoskehityksen lähteitä. Samaan aikaan alkion kohta, esimerkiksi viiriäinen, siirretään samaan kanan alkion paikkaan etäisen paikan tilalle. Viiriäisen solujen ytimillä on tyypillinen rakenne, ja ne voidaan siksi erottaa kanan alkiosolujen ytimistä.
selitys- pienen alkion alueen leikkaaminen ja sen viljely keinotekoisessa ympäristössä. Tällä menetelmällä on mahdollista saada tietoa kudoskehityksen lähteistä tietyltä alkion alueelta ja tunnistaa histogeneettisiä kehitysmalleja.
Ydinsiirto- menetelmä alkioiden kloonaamiseksi. Esimerkiksi kynsisen sammakon nuijapäisen suoliepiteelin soluista tumien siirtäminen sammakonmunaan, jonka ydin inaktivoitui ultraviolettisäteen vaikutuksesta, johti uusien yksilöiden ilmaantumiseen (Gerdonin kokeet). Nämä kokeet loivat perustan korkeampien selkärankaisten kloonaukselle ja vaikuttivat (vuonna 1997) kuuluisan lampaan Dollyn ilmestymiseen. Samanlaiset embryologiset kokeet ovat vakuuttavasti osoittaneet, että somaattisten solujen ytimet sisältävät täydellisen joukon geneettistä informaatiota uuden organismin kehittämiseksi.
Viimeisin saavutus kokeellinen embryologia oli koeputkihedelmöitysmenetelmän kehittäminen. In vitro syntyneiden alkioiden siirto kohtuun on hedelmättömyyshoidon perusta. Vuonna 1973 L. Shettles (USA) poisti hedelmättömän naisen munasarjasta ovulaatiota edeltävän munasolun ja hedelmöitti sen miehensä siittiöillä. Tämä oli alku tekniikalle, jossa ihmisalkiot siirrettiin hedelmättömyyden hoitoon. Kuitenkin vasta vuonna 1978 Yhdistyneessä kuningaskunnassa, kun hedelmättömän naisen kohtuun siirrettiin onnistuneesti 8 blastomeerin vaiheessa oleva ihmisalkio, 2,5 päivän viljelyn jälkeen, maailman ensimmäinen "koeputki" painava lapsi 2700 g ilmestyi.