Histološke metode istraživanja koriste se za proučavanje strukture i funkcije stanica i tkiva ljudi, životinja i biljaka u normalnim, patološkim i eksperimentalnim uvjetima. Osnova G. m. i. je - skup metodoloških tehnika koje se koriste u izradi pripravaka stanica i tkiva za njihovo mikroskopsko ispitivanje. Mikroskopsko istraživanje stanica i tkiva može se provesti na dva glavna načina, ovisno o stanju predmeta koji se proučava: proučavanje živih stanica i tkiva, proučavanje neživih stanica i tkiva koja zadržavaju svoju strukturu zbog posebne fiksacije. Tehnike. Proučavanje živih objekata - vitalnih (supravitalnih) - omogućuje promatranje fizioloških procesa u stanicama i tkivima, njihovu intravitalnu strukturu. Provodi se na stanicama slobodno suspendiranim u tekućem mediju (krvne stanice, epitelne stanice strugotina itd.), kao i na kulturama stanica i tkiva uzgojenim na posebnim hranjivim medijima. Predmet intravitalnog promatranja mogu biti tanki, prozirni filmovi tkiva (plivaća membrana). U eksperimentalnim studijama koristi se metoda bioloških prozora (implantacija prozirnih komora) i proučavanje tkivnih implantata u prirodnom prozirnom okruženju, na primjer, u prednjoj komori oka životinja. Ovisno o zadatku, u vitalnim istraživanjima koriste se različite specijalne mikroskopske metode: tamnopolje, fazno-kontrast, fluorescencija, polarizacija, ultraljubičasto. Vitalne histološke metode uglavnom se koriste za biološka i biomedicinska istraživanja. Njihova raširena uporaba ograničena je velikim tehničkim poteškoćama povezanim sa svojstvima preživjelih tkiva. U medicinskim istraživanjima, posebno u praksi laboratorija za anatomsku patologiju, koriste se metode proučavanja fiksnih predmeta. Svrha fiksacije je očuvanje intravitalne strukture stanica i tkiva brzim izlaganjem kemijskim agensima koji sprječavaju razvoj posmrtnih promjena. Odabir metode fiksiranja ovisi o ciljevima studije i karakteristikama materijala koji se fiksira. Tako se za identifikaciju tankih staničnih struktura koriste smjese za fiksiranje koje sadrže soli teških metala (npr. sublimat).Najbolji fiksativ za citološke svrhe je osmijev tetroksid, koji se često koristi u elektronskoj mikroskopiji. Univerzalni fiksativ je formaldehid, koji se koristi u obliku 10% otopine formalina. Da bi bili ujednačeni i cjeloviti, komadići tkiva moraju biti mali, a volumen tekućine za fiksiranje mora biti višestruko veći od volumena materijala koji se fiksira. Nakon fiksacije komadi se obično peru u vodi ili alkoholu. Komponente čvrstog tkiva (npr. naslage kalcija) uklanjaju se tehnikama dekalcifikacije. Najbrži i najlakši način pripreme isječka tkiva, koji se obično koristi u ekspresnoj dijagnostici, je komad i dobivanje isječaka tkiva na mikrotomu za zamrzavanje. Međutim, teško je dobiti dovoljno tanke rezove, kao i rezove malih predmeta i raspadajućih tkiva. Stoga se komadići tkiva, u pravilu, ulijevaju u medij za brtvljenje - ili celoidin. Fiksirani se dehidrira u alkoholima rastuće jakosti, prolazi kroz srednje otapalo (ksilol ili za parafin, alkohol-eter za celoidin) i impregnira parafinom ili celoidinom. u parafinu omogućuje dobivanje tanjih rezova (od 5-8 do 1-2 mikron) nego celoidin. Isječci za mikroskopsko ispitivanje pripremaju se pomoću stakalca ili rotacijskog mikrotoma. Ultratanke sekcije (debljine od 90-100 do 5-15 nm) potrebne za elektronsko mikroskopsko istraživanje pripremaju se na ultratomu. Ultratomi se također koriste u svjetlosnoj mikroskopiji za dobivanje polutankih rezova. Pripremljeni rezovi se boje kako bi se jasno istaknule strukture stanica i tkiva koje različito percipiraju boje. Glavne boje - baze za bojanje i njihove soli (toluidin plavo, azurno, bismarck smeđe) - boje takozvane bazofilne strukture (stanične jezgre, vezivno tkivo). Kisele boje - boje kiseline i njihove soli (pikrinska kiselina, eritrozin) - boje acidofilne ili oksifilne strukture (stanična citoplazma, kolagen, elastična vlakna). bojenje treba razlikovati impregnacijom - posebnom metodom koja se temelji na određenim područjima stanica i tkiva za vraćanje teških metala (na primjer, srebro, zlato, osmij) iz njihovih soli i time dobiva intenzivnu boju. Izrada histološkog preparata završava se stavljanjem u medije koji osiguravaju očuvanje strukture predmeta, njegove boje i prozirnosti. Najčešće se u te svrhe koriste npr. organske smole.
1. Mala medicinska enciklopedija. - M.: Medicinska enciklopedija. 1991-96 2. Prva pomoć. - M.: Velika ruska enciklopedija. 1994 3. Enciklopedijski rječnik medicinskih pojmova. - M.: Sovjetska enciklopedija. - 1982-1984.
Pogledajte što su "histološke metode istraživanja" u drugim rječnicima:
Metodički pristupi i metode istraživanja u anatomiji čovjeka– Ponekad se čuje da u anatomiji nema više ništa za proučavanje, istraživanje, navodno su sve teme iscrpljene, sve što se moglo proučavati već je proučavano, sva su pitanja riješena. Kao da sve što se tiče strukture ljudskog tijela, ... ... Rječnik pojmova i pojmova o ljudskoj anatomiji
LABORATORIJSKA ISTRAŽIVANJA- LABORATORIJSKA ISTRAŽIVANJA. vidi LABORATORIJSKE STUDIJE. Najvažniji uvjet za dobivanje pouzdanih rezultata istraživanja je pravilan odabir objekata analize, njihov pravovremeni izbor i formuliranje problema istraživanja. Pravila uzorkovanja… Bolesti riba: priručnik
I Medicina Medicina je sustav znanstvenih spoznaja i prakse usmjeren na jačanje i očuvanje zdravlja, produljenje života ljudi te sprječavanje i liječenje ljudskih bolesti. Da bi ispunio ove zadatke, M. proučava strukturu i ... ... Medicinska enciklopedija
Načini proučavanja različitih predmeta pomoću mikroskopa. U biologiji i medicini ove metode omogućuju proučavanje strukture mikroskopskih objekata čije dimenzije nadilaze razlučivost ljudskog oka. Osnova M.m.i. šminka…… Medicinska enciklopedija
- (histološka cytus stanica + grčki logos doktrina) temelji se na mikroskopskom proučavanju strukturnih značajki stanica, staničnog sastava tkiva organa, tjelesnih tekućina ljudi i životinja u normalnim i patološkim procesima. C. i ... ... Medicinska enciklopedija
I Histologija (grč. histos tkivo + logos učenje) je biomedicinska znanost koja proučava evoluciju tkiva, njihov razvoj u tijelu (histogeneza), građu, funkcije i međudjelovanje u višestaničnih životinja i čovjeka. Glavni predmet proučavanja G. ... ... Medicinska enciklopedija
I Stidnica (vulva; pudendum femininum) vanjski ženski spolni organi (prema Međunarodnoj anatomskoj nomenklaturi žensko spolno područje). Anatomija i fiziologija. Vulva (slika 1) nalazi se izvan stidnih kostiju zdjelice i pričvršćena je na njih ... ... Medicinska enciklopedija
Proučavajući promjene koje u tijelu izazivaju različiti bolesni procesi, on svojim istraživačkim metodama ima za cilj utvrditi kako te bolesti, tako i njihov značaj u odnosu na kliničku sliku bolesti i smrti... ... Enciklopedijski rječnik F.A. Brockhaus i I.A. Efron
I Biopsija (grč. bios život + opsis vid, vidna percepcija) intravitalno uzimanje tkiva, organa ili staničnih suspenzija za mikroskopsko ispitivanje u dijagnostičke svrhe, kao i za proučavanje dinamike patološkog procesa i utjecaja na ... ... Medicinska enciklopedija
Znanost koja proučava tkiva životinja. Tkivo je skupina stanica koje su slične po obliku, veličini i funkciji te po svojim metaboličkim produktima. Kod svih biljaka i životinja, s izuzetkom najprimitivnijih, tijelo se sastoji od tkiva, ... ... Collier Encyclopedia
- (od grč. ἱστός tkivo i grč. λόγος znanje, riječ, nauka) grana biologije koja proučava građu tkiva živih organizama. To se obično radi seciranjem tkiva na tanke slojeve i korištenjem mikrotoma. Za razliku od anatomije, ... ... Wikipedia
knjige
- Multipli mijelom i bolesti plazma stanica, Ramasami Kartik, Lonial Sagar. U knjizi su prikazani glavni klinički aspekti multiplog mijeloma i drugih bolesti plazma stanica. Opisane su laboratorijske studije, patogeneza, dijagnoza i liječenje. U drugom…
Objekti proučavanja mogu biti fiksne (mrtve) ili žive stanice i tkiva.
Za proučavanje mikrostrukture sirovina i stočarskih proizvoda u pravilu se koriste fiksne stanice i tkiva. Preparati su privremeni, namijenjeni jednom istraživanju, i trajni, koji se mogu čuvati i više puta pregledavati. Osim toga, koriste se totalni ili cijeli pripravci.
Privremeni lijekovi može se kuhati relativno brzo; za to se materijal koji se proučava fiksira i rezovi se dobivaju na mikrotomu za zamrzavanje; u njegovom odsustvu, tanki presjek tkiva ili organa može se napraviti skalpelom ili oštricom. Dobiveni presjek se oboji, stavi na predmetno staklo, a zatim se nanese kap glicerina i prekrije pokrovnim stakalcem. Za otkrivanje škroba koristi se otopina joda u kalijevom jodidu: 0,5 g kalijevog jodida otopi se u maloj količini vode, doda se 1 g kristalnog joda i doda se voda na 100 cm 3. Nekoliko kapi reagensa nanese se na tanki komadić kobasice, sira i drugog materijala koji se nalazi na stakalcu, škrob postaje plavo-ljubičast.
Ukupni ili cijeli pripravci ispitati bez dobivanja isječka tkiva ili organa. Na primjer, film potkožnog tkiva ili usitnjeni pripravak korijena biljke nakon fiksacije, pranja i bojenja stavlja se između stakalca i pokrovnog stakalca. Za identifikaciju pojedinih strukturnih elemenata, fiksirani i obojeni komadići potkožnog tkiva ili glatkog mišićnog tkiva čupaju se iglom na predmetnom staklu - takvi se preparati nazivaju plukirani. U nekim slučajevima, na primjer, pri pregledu filma mrežnice očne jabučice ili kože punoglavca, nakon fiksacije i pranja, bojanje se ne provodi, budući da stanice sadrže organske inkluzije (pigment) koji imaju prirodnu boju.
Metoda pripreme histološkog preparata. Glavna metoda proučavanja fiksnih stanica i tkiva je histološka, tj. proučavanje obojenog dijela tkiva zatvorenog u posebnom mediju. Za dobivanje rezova koristi se izlijevanje ispitnog materijala u parafin ili celoidin, što omogućuje dobivanje tankih rezova (5-7 mikrona, odnosno 10-30 mikrona), za brzu pripremu rezova (40-60 mikrona), zamrzavanje koristi se tehnika.
Glavne faze u pripremi histološkog preparata su: uzimanje uzorka, fiksacija, pranje, dehidracija, utapanje u parafin ili celoidin, bojenje, stavljanje pod pokrovno stakalce.
Izbor uzorka izrađuje se uzimajući u obzir svrhu studije i strukturu građe. Veličina uzorka u prosjeku ne smije biti veća od 2,5-3,0 cm.Uzorci jetre i slezene uzimaju se kapsulom. Iz srca su izrezani komadići atrija, jer su membrane tanje nego u klijetkama i na jednom preparatu vidi se topografski odnos epikarda, miokarda i endokarda. Iz bubrega, limfnih čvorova, nadbubrežnih žlijezda izrezuju se dijelovi organa koji ulaze duboko u površinu okomito na površinu tako da se na preparatu otkriju kora i srž. Ako je potrebno pripremiti preparate promijenjenih organa, komadići ispitivanog materijala se izrezuju na granici sa zahvaćenim područjem tako da prijelazna zona lezije bude uključena u uzorak. Uzorke skeletnih mišića treba izrezati tako da mišićna vlakna budu u uzdužnom i poprečnom presjeku. Uzorci uzoraka mljevenog mesa, svježeg sira i drugih mrvljivih uzoraka najprije se stave u komad gaze i zavežu koncem. Treba imati na umu da se prilikom otvaranja prsne šupljine pluća zbog elastičnosti kolabiraju, značajno gube prozračnost, pa se u dušnik ekstrahiranih dišnih organa umetne staklena ili gumena cijev kroz koju se umjereno ubrizgava zrak . Ispod umetnute cijevi na dušnik se stavlja svilena ligatura i veže se teret za potpuno uranjanje. Za fiksiranje crijeva, dio organa namijenjen za fiksaciju prethodno se zavije ligaturama s obje strane. Uzorci su opremljeni debelim papirnatim naljepnicama s brojem i datumom uzorkovanja.
fiksacija, oni. Očuvanje prirodne (životne) arhitektonike provodi se kako bi se živa protoplazma građevina prevela u nepromjenjivo stanje. Djelovanje fiksativa očituje se u činjenici da kao rezultat biofizičkih procesa dolazi do nepovratne koagulacije proteina u tkivima i organima. Uzorak tkiva uzet iz organa što je prije moguće uroni u fiksativ; omjer volumena materijala i tekućine za fiksiranje mora biti najmanje 1:9 (slika 3).
Fiksacija dovodi do određenog zbijanja i smanjenja volumena uzorka. Najčešće se za fiksaciju koristi 10-12% formalin, etilni alkohol, aceton. Za pripremu navedene koncentracije tekućine za fiksiranje, 40% formalin se razrijedi vodom iz slavine. Etilni alkohol (100% apsolutni ili 96%) koristi se u slučajevima kada je potrebno identificirati tvari koje se otapaju u vodenim fiksativima (na primjer, glikogen) u dijelovima. U acetonu se materijal koji se proučava (na primjer, mozak) fiksira samo nekoliko sati. Kada organ koji se proučava, kao što je koštano tkivo, sadrži vapno, provodi se dekalcifikacija ili kalcifikacija. Da biste to učinili, mali komad kosti se spusti (bolje ga je objesiti na konac) u 5-8% vodenoj otopini dušične kiseline, koja se mijenja 2-3 puta dnevno. Rezultat dekalcifikacije procjenjuje se zabadanjem tanke igle u kost: ako nema otpora, dekalcifikacija je završena. Nakon takvog pro-
ispiranje provodi se kako bi se uklonio višak fiksativa, na primjer, nakon fiksacije s formalinom, pranje se provodi tekućom vodom iz slavine.
Dehidracija provodi se za zbijanje materijala u etilnom alkoholu rastuće koncentracije: 50-70-100. Za pripremu 50% i 70% alkohola, 96% alkohol se razrijedi destiliranom vodom. Za pripremu 100% alkohola potrebno je zagrijati bakar sulfat do potpune dehidracije i dodati 96% etilni alkohol u dehidrirani bijeli prah. U svakoj koncentraciji alkohola, materijal se drži 1-24 sata, ovisno o veličini komada, strukturi organa; u 70% alkoholu materijal se može čuvati nekoliko dana.
ispuniti provodi se u takvom mediju da ispitni uzorak postane čvrst, što omogućuje dobivanje tankih presjeka. Da biste to učinili, koristite parafin (impregnacija 1-4 sata), celoidin (impregnacija tri tjedna). Prilikom otkrivanja masti i za proučavanje labavih tkiva i organa koristi se ulijevanje u želatinu.
kriške primiti na saonicama ili rotacijskim mikrotomima. Najtanji rezovi (5-7 mikrona) mogu se izraditi od materijala uklopljenog u parafin. Od materijala ispunjenog celoidinom pripremaju se rezovi debljine 15-20 mikrona. Za proučavanje mikrostrukture sirovina i proizvoda životinjskog podrijetla u pravilu se koristi tehnika zamrzavanja. Time se ubrzava priprema pripravka, jer se eliminiraju duge faze dehidracije i lijevanja. Nakon fiksacije i pranja, komadi predmeta stavljaju se na mokri postolje mikrotoma za zamrzavanje i dobivaju se rezovi debljine 40-60 μm. Dijelovi se četkom prenose u vodu, gdje se ispravljaju, poprimajući izgled najtanjih sivkastih komadića.
Bojanje presjeka provodi se radi povećanja kontrasta različitih struktura u preparatima namijenjenim ispitivanju u svjetlosnom mikroskopu. U procesu bojenja odvijaju se složeni kemijski i fizikalni procesi, stoga se pri odabiru metode uzima u obzir selektivni afinitet staničnih struktura za pojedina bojila s različitim fizikalno-kemijskim svojstvima.
Postoje boje osnovne (bazalne), kisele i posebne. Strukture obojene osnovnim bojama nazivaju se bazofilan, kisele boje - oksifilni, acidofilni, eozinofilni.
Od osnovnih (bazalnih) boja koristi se hematoksilin koji boji kromatin jezgre i drugih struktura koje sadrže protein u plavu ili ljubičastu boju; karmin, bojenje jezgre u svijetlocrvenu boju, safranin - tamnocrvena boja, tionin - plava boja.
Od kiselih boja koristi se eozin (boji citoplazmu ružičasto), pikrinska kiselina (žuto), fuksin (boja cigle), indigo karmin (plavo).
Pri proučavanju mikrostrukture sirovina i stočarskih proizvoda najčešće se koristi kombinirano bojenje hematoksilinom i eozinom. Da bi se to učinilo, dijelovi iz vode se prenose 1-3 minute u otopinu hematoksilina; Pranje u vodi 20-30 minuta, stavljanje u otopinu eozina 3-5 minuta i ispiranje vodom 3-5 minuta. Preostala voda se ukloni filtar papirom, nanese kap 96% etanola 1-2 minute i dehidrira u 25% otopini karbolne kiseline u ksilenu ili toluenu. Zatim se na posjekotinu nakapaju 1-2 kapi melema i pokriju pokrovnim stakalcem.
Od bojila koja boje masne inkluzije često se koristi Sudan 111. Za pripremu otopine boje u 95 cm 3 85% etilnog alkohola doda se 5 cm 3 acetona i ulijeva prah Sudan III dok se ne dobije zasićena otopina (tj. boja mora biti sadržana u suvišku). Smjesa se zagrije na 50% C i filtrira. Presjeci dobiveni na mikrotomu za zamrzavanje stavljaju se u 50% etanol na 1-2 minute, a zatim u Sudan III na 25 minuta. Sekcije se isperu u 50% alkoholu, isperu destiliranom vodom i utope u glicerol-želatinu.
Kapljice neutralne masti postaju narančaste zbog otapanja Sudana III u mastima. Masne inkluzije mogu se otkriti i osminskom kiselinom, dok su masne strukture obojene u crno.
Zaključak ispod pokrovnog stakala provodi se u okruženjima koja ne propuštaju zrak i mogu dugo zadržati rez. Obojeni rezovi dehidriraju se u alkoholima sve veće jačine i stavljaju pod pokrovno stakalce u jelovinu, kanadski balzam ili glicerol-želatinu (preparat ne smije doći u dodir s alkoholima i ksilolom).
Priprema uzoraka za elektronsku mikroskopiju. Za proučavanje bioloških objekata koriste se dvije vrste elektronskih mikroskopa: prijenosni (transmisijski) i skenirajući (raster).
Princip obrade predmeta za ispitivanje u transmisijskom elektronskom mikroskopu temelji se na istim principima kao i kod optičkih mikroskopa: uzorkovanje, fiksacija, pranje, dehidracija, izlijevanje, priprema ultratankih rezova, kontrastiranje.
Izbor uzorka provodi se uzimajući u obzir svrhu studije i strukturu materijala, u skladu s istim pravilima kao i za svjetlosnu mikroskopiju. Volumen komada ispitivanog materijala ne smije biti veći od 1 mm 3 . Glavna svrha fiksacije je održati tkivo što je moguće bliže životu.
Fiksacija Provodi se radi boljeg očuvanja struktura, stoga je potrebno koristiti reagense s određenim pH i izotoničnošću, čije su vrijednosti određene vrstom tkiva koje se fiksira. Proces fiksacije provodi se u dvije faze: prefiksacija i postfiksacija. Za prefiksaciju se koristi otopina 2,5-3% otopine glutaraldehida (pH 7,2-7,4), trajanje fiksacije je 2-4 sata. Postfiksacija se provodi u 2% otopini (pH 7,2-7,4) - 1- 2 sata Za očuvanje intravitalne strukture preporuča se koristiti niskotemperaturni fiksativ (0-4 °C), te pripremiti fiksative na otopinama fosfatnog pufera, kakodilata, veronal-acetata.
ispiranje provodi se 30% hladnim alkoholom 5-7 puta, predmet se drži u svakoj porciji alkohola 30 minuta, t.j. isprani od fiksativa do takvog stanja kada prestaje oksidacijsko djelovanje fiksativa.
Dehidracija provesti s etilnim alkoholima rastuće jačine: 30, 50, 70, 96, 100% 30 minuta. Za neke metode izlijevanja preporučuje se dodavanje acetona i propilen oksida za odvodnjavanje.
ispuniti izvodi se u epoksidnim smolama (araldit, epon itd.). Polimerizacija smola u kapsulama provodi se u termostatu na 60 °C do stvrdnjavanja, u pravilu unutar 1-2 dana.
Ultratanki dijelovi dobivaju se pomoću staklenih noževa na ultramikrotomu; za to se epoksidni blokovi oštre u obliku tetraedarske skraćene piramide. Serijski sivkasti rezovi se stavljaju u kupku s 10% etanola. Rezultirajuće sekcije montiraju se na bakrene ili paladijeve mreže, na čiju se površinu prethodno nanosi film od formvara. Da bi se otkrile potrebne strukture, dijelovi na mrežicama tretiraju se otopinama olovnog citrata i uranil acetata.
Za skenirajuća elektronska mikroskopija ispitni uzorak je fiksiran, dehidriran, ovisno o svrsi studije, koristeći gore navedene fiksative. Nakon dehidracije, uzorak se lijepi na držač, stavlja u jedinicu za raspršivanje i oblaže vrlo tankim slojem zlata ili platine. Za razliku od transmisijske elektronske mikroskopije, skenirajuća elektronska mikroskopija može koristiti korozivne pripravke: predmet proučavanja se prelije nekim otvrdnjavajućim tvarima, a zatim se ispituju odljevci i površine. Proučavaju i replike dobivene zamrzavanjem – čipiranjem. U tom slučaju ispituje se otisak rascjepa površine predmeta. Da bi se povećao kontrast, replike se moraju zasjeniti prskanjem metalnih čestica (zlato, platina) ili ugljena.
ispitna pitanja
- 1. Koje se metode koriste u proučavanju staničnih struktura, tkiva i organa?
- 2. Koja su osnovna pravila uzimanja uzoraka za izradu histoloških preparata?
- 3. Koje su značajke pripreme pripravaka iz koštanog tkiva?
- 4. Kako se ispitni materijal fiksira?
- 5. Što se koristi za dehidraciju pripravaka?
- 6. Koji mediji se koriste za izlijevanje ispitnog materijala?
- 7. Koja se boja koristi za otkrivanje masnog tkiva?
- 8. Koja je metoda sekcije najčešće korištena i zašto?
- 9. Navedite glavne faze pripreme uzoraka za transmisijsku i skenirajuću elektronsku mikroskopiju.
Histologija - ("gistos" na grčkom - tkivo, logis - učenje) Ovo je znanost o građi, razvoju i životnoj aktivnosti tkiva višestaničnih organizama i čovjeka. Predmeti koji su predmet ove znanosti nedostupni su golim okom. Stoga je povijest histologije usko povezana s poviješću stvaranja takvih instrumenata koji nam omogućuju proučavanje najmanjih objekata golim okom. 2
Tečaj histologije je konvencionalno podijeljen u sljedeće dijelove: n 1. Citologija je znanost o stanici. n 2. Embriologija je znanost o razvoju, od nastanka do potpunog formiranja organizma. n 3. Opća histologija - znanost o općim uzorcima svojstvenim tkivima. n 4. Privatna histologija - proučava građu, razvoj organa i sustava.
CITOLOGIJA - (grč. κύτος "stanica" i λόγος - "proučavanje", "znanost") n Grana biologije koja proučava žive stanice, njihove organele, njihovu strukturu, funkcioniranje, procese reprodukcije stanica, starenje i smrt. četiri
EMBRIOLOGIJA n (od dr. -grč. ἔμβρυον - embrij, embrij + -λογία od λόγος - učenje) je znanost koja proučava razvoj embrija. 5
Povijest nastanka stanične teorije 1590. Jansen je izumio mikroskop, u kojem je povećanje osigurano spajanjem dviju leća. 1665. Robert Hooke prvi je upotrijebio termin ćelija. 1650-1700 godina. Anthony van Leeuwenhoek prvi je opisao bakterije i druge mikroorganizme. 1700 -1800 godina. Objavljeno je mnogo novih opisa i crteža raznih tkiva, uglavnom biljnih. Godine 1827. Karl Baer otkrio je jaje kod sisavaca. 1831 -1833 godine. Robert Brown opisao je jezgru u biljnim stanicama. 1838-1839 godina. Botaničar Matthias Schleiden i zoolog Theodor Schwann spojili su ideje različitih znanstvenika i formulirali staničnu teoriju, koja je postulirala da je osnovna jedinica strukture i funkcije živih organizama stanica. 1855. godine Rudolf Virchow je pokazao da sve stanice nastaju kao rezultat staničnih dioba.
Povijest nastanka stanične teorije 1665. Proučavajući dio pluta pod mikroskopom, engleski znanstvenik, fizičar Robert Hooke otkrio je da se sastoji od stanica odvojenih pregradama. Ove stanice nazvao je "stanice"
Povijest nastanka stanične teorije Leeuwenhoek je u 17. stoljeću dizajnirao mikroskop i ljudima otvorio vrata u mikrokozmos. Pred očima zaprepaštenih istraživača bljesnuli su razni trepetljikaši, rotatori i druga sićušna živa bića. Pokazalo se da ih ima posvuda - tih najmanjih organizama: u vodi, gnoju, u zraku i prašini, u zemlji i olucima, u trulom otpadu životinjskog i biljnog podrijetla.
Povijest stvaranja stanične teorije 1831-1833. Robert Brown opisao je jezgru u biljnim stanicama. Godine 1838. njemački botaničar M. Schleiden skrenuo je pozornost na jezgru i smatrao je začetnikom stanice. Prema Schleidenu, iz zrnate tvari kondenzira se jezgrica, oko koje se formira jezgra, a oko jezgre - stanica, a jezgra može nestati u procesu stvaranja stanice.
Povijest nastanka stanične teorije Njemački zoolog T. Schwann pokazao je da se i životinjska tkiva sastoje od stanica. Stvorio je teoriju prema kojoj stanice koje sadrže jezgre predstavljaju strukturnu i funkcionalnu osnovu svih živih bića. Staničnu teoriju strukture formulirao je i objavio T. Schwann 1839. godine. Njezina se bit može izraziti u sljedećim odredbama: 1. Stanica je elementarna strukturna jedinica strukture svih živih bića; 2. Stanice biljaka i životinja su neovisne, homologne jedna drugoj po podrijetlu i građi. Svaka stanica funkcionira neovisno o drugima, ali zajedno sa svima. 3. Sve stanice nastaju iz međustanične tvari bez strukture. (Greška!) 4. Životnu aktivnost stanice određuje ljuska. (Pogreška!)
Povijest nastanka stanične teorije 1855. godine njemački liječnik R. Virchow generalizirao je: stanica može nastati samo iz prethodne stanice. To je dovelo do spoznaje da su rast i razvoj organizama povezani s diobom stanica i njihovom daljnjom diferencijacijom, što dovodi do stvaranja tkiva i organa.
Povijest stvaranja stanične teorije Karla Baera Davne 1827. godine Karl Baer je otkrio jaje kod sisavaca, dokazao da razvoj sisavaca počinje s oplođenim jajetom. To znači da razvoj svakog organizma počinje jednim oplođenim jajetom, stanica je jedinica razvoja.
Povijest nastanka stanične teorije 1865. Objavljeni su zakoni nasljeđa (G. Mendel). 1868. Otkrivene su nukleinske kiseline (F. Miescher) 1873. Otkriveni su kromosomi (F. Schneider) 1874. Otkrivena je mitoza u biljnim stanicama (I. D. Čistjakov) 1878. Otkrivena je mitotička dioba životinjskih stanica (W. Fleming, P. I. Peremezhko) 1879. Fleming - ponašanje kromosoma tijekom diobe. 1882. Mejoza je otkrivena u životinjskim stanicama (W. Fleming) 1883. Pokazalo se da je broj kromosoma u zametnim stanicama dva puta manji nego u somatskim stanicama (E. Van Beneden) 1887. Mejoza je otkrivena u biljnim stanicama (E. Strasburger ) 1898. Golgi je otkrio mrežasti aparat stanice, Golgijev aparat. 1914. Formulirana je kromosomska teorija nasljeđivanja (T. Morgan). 1924. Objavljena prirodno-znanstvena teorija o postanku života na Zemlji (A. I. Oparin). 1953. Formulirane su ideje o strukturi DNA i stvoren njezin model (D. Watson i F. Crick). 1961. Utvrđuju se priroda i svojstva genetskog koda (F. Crick, L. Barnet, S. Benner).
Glavne odredbe moderne stanične teorije 1. Stanica je elementarni živi sustav, jedinica strukture, vitalne aktivnosti, reprodukcije i individualnog razvoja organizama. 2. Stanice svih živih organizama su homologne, ujednačene po građi i podrijetlu. 3. Stvaranje stanica. Nove stanice nastaju samo diobom već postojećih stanica. 4. Stanica i organizam. Stanica može biti samostalan organizam (prokarioti i jednostanični eukarioti). Svi višestanični organizmi sastoje se od stanica. 5. Funkcije stanica. U stanicama se odvija metabolizam, nadražljivost i nadražljivost, kretanje, razmnožavanje i diferencijacija. 6. Evolucija stanice. Stanična organizacija nastala je u praskozorju života i prešla je dug put evolucijskog razvoja od oblika bez jezgre (prokariota) do oblika jezgre (eukariota).
METODE MIKROSKOPIJE HISTOLOŠKIH PREPARATA 1. Svjetlosna mikroskopija. 2. Ultraljubičasta mikroskopija. 3. Fluorescentna (luminiscentna) mikroskopija. 4. Fazno kontrastna mikroskopija. 5. Mikroskopija tamnog polja. 6. Interferencijska mikroskopija 7. Polarizacijska mikroskopija. 8. Elektronska mikroskopija. 17
Mikroskop n Ovaj optički instrument omogućuje promatranje malih predmeta. Povećanje slike postiže se sustavom objektiva i okulara. Zrcalo, kondenzator i dijafragma usmjeravaju svjetlosni tok i reguliraju osvijetljenost predmeta. Mehanički dio mikroskopa uključuje: stativ, predmetni stol, makro i mikrometarske vijke, držač cijevi. osamnaest
Posebne metode mikroskopije: - fazno-kontrastni mikroskop - (za proučavanje živih neobojanih predmeta) - mikroskopija omogućuje proučavanje živih i neobojanih predmeta. Prolaskom svjetlosti kroz obojene objekte mijenja se amplituda svjetlosnog vala, a prolaskom svjetlosti kroz neobojene objekte mijenja se faza svjetlosnog vala, što se koristi za dobivanje slike visokog kontrasta u fazno-kontrastnoj i interferencijskoj mikroskopiji. - mikroskop tamnog polja (za proučavanje živih neobojanih objekata). Koristi se poseban kondenzator koji ističe kontrastne strukture neobojenog materijala. Mikroskopija tamnog polja omogućuje promatranje živih objekata. Promatrani objekt izgleda kao osvijetljen u tamnom polju. U tom slučaju zrake iz iluminatora padaju na predmet sa strane, a samo raspršene zrake ulaze u leće mikroskopa. 19
Posebne metode mikroskopije Luminescent mic-p (za proučavanje živih neobojanih objekata) Mikroskopija se koristi za promatranje fluorescentnih (svjetlećih) objekata. U fluorescentnom mikroskopu svjetlost iz snažnog izvora prolazi kroz dva filtra. Jedan filtar blokira svjetlost ispred uzorka i dopušta svjetlosti valne duljine koja pobuđuje uzorak da fluorescira. Drugi filtar propušta svjetlost valne duljine koju emitira fluorescentni objekt. Dakle, fluorescentni objekti apsorbiraju svjetlost jedne valne duljine i emitiraju svjetlost u drugom području spektra. -ultraljubičasta sposobnost m-pa) mic-p (povećava rezoluciju -polarizacija mic-p (za objekte istraživanja s urednim rasporedom molekula - kostur, mišić, kolagena vlakna itd.) mikroskopija - stvaranje slike neobojenih anizotropnih struktura (npr. kao kolagena vlakna i miofibrile).20
Posebne metode mikroskopije – interferencijska mikroskopija (za određivanje suhog ostatka u stanicama, određivanje debljine predmeta) – mikroskopija kombinira principe fazno-kontrastne i polarizacijske mikroskopije i koristi se za dobivanje kontrastne slike neobojanih predmeta. Posebna interferencijska optika (Nomarsky optika) našla je primjenu u mikroskopima s diferencijalnim interferencijskim kontrastom. C. Elektronska mikroskopija: -transmisija (proučavanje objekata transmisijom) -skeniranje (proučavanje površine predmeta) Teoretski, razlučivost transmisijskog EM-a je 0,002 nm. Prava razlučivost modernih mikroskopa približava se 0,1 nm. Za biološke objekte, EM rezolucija u praksi je 2 nm. 21
Posebne mikroskopske tehnike Transmisijski elektronski mikroskop sastoji se od stupca kroz koji u vakuumu prolaze elektroni koje emitira katodna nit. Kroz pripremljeni uzorak prolazi snop elektrona fokusiran prstenastim magnetima. Karakter raspršenja elektrona ovisi o gustoći uzorka. Elektroni koji prolaze kroz uzorak se fokusiraju, promatraju na fluorescentnom ekranu i bilježe pomoću fotografske ploče. Skenirajući elektronski mikroskop koristi se za dobivanje trodimenzionalne slike površine predmeta koji se proučava. Metoda čipiranja (smrzavanje-cijepanje) koristi se za proučavanje unutarnje strukture staničnih membrana. Stanice se zamrzavaju na temperaturi tekućeg dušika u prisutnosti krioprotektora i koriste se za izradu čipsa. Plohe cijepanja prolaze kroz hidrofobnu sredinu lipidnog dvosloja. Izložena unutarnja površina membrana osjenčana je platinom, dobivene replike se proučavaju u skenirajućem EM-u. 22
Specijalne (nemikroskopske) metode: 1. Cito- ili histokemija - suština je korištenjem strogo specifičnih kemijskih reakcija s lakim krajnjim produktom u stanicama i tkivima za određivanje količine različitih tvari (proteina, enzima, masti, ugljikohidrata, itd.). Može se primijeniti na razini svjetlosnog ili elektronskog mikroskopa. 2. Citopotometrija - metoda se koristi u kombinaciji s 1 i omogućuje kvantificiranje proteina, enzima i sl. identificiranih citohistokemijskom metodom 3. Autoradiografija - u organizam se unose tvari koje sadrže radioaktivne izotope kemijskih elemenata. Te su tvari uključene u metaboličke procese u stanicama. Lokalizacija, daljnje kretanje ovih tvari u organima utvrđuje se na histološkim preparatima zračenjem, koje se bilježi fotografskom emulzijom nanesenom na preparat. 4. Analiza rendgenske difrakcije - omogućuje određivanje količine kemijskih elemenata u stanicama, proučavanje molekularne strukture bioloških mikroobjekata. 24 5. Morfometrija - mjerenje veličine biol. strukture na staničnoj i substaničnoj razini.
Specijalne (nemikroskopske) metode 6. Mikrokirgija - izvođenje vrlo delikatnih operacija mikromanipulatorom pod mikroskopom (transplantacija jezgre, unošenje raznih tvari u stanice, mjerenje biopotencijala i dr.) 6. Metoda uzgoja stanica i tkiva - u hranjivim medijima ili u difuzijskim komorama, implantirani u različita tjelesna tkiva. 7. Ultracentrifugiranje - frakcioniranje stanica ili subcelularnih struktura centrifugiranjem u otopinama različite gustoće. 8. Eksperimentalna metoda. 9. Metoda transplantacije tkiva i organa. 25
Fiksacija čuva strukturu stanica, tkiva i organa, sprječava njihovu bakterijsku kontaminaciju i enzimatsku probavu te stabilizira makromolekule njihovim kemijskim umrežavanjem. 32
Fiksirajući tekući formalin, alkoholi, glutaraldehid - Najčešći fiksativi; Kriofiksacija - Najbolje očuvanje struktura osigurava se trenutnim zamrzavanjem uzoraka u tekućem dušiku (-196 °C); Liofilizacija - mali komadići tkiva podvrgavaju se brzom smrzavanju, čime se zaustavljaju metabolički procesi. Dehidracija - standardni postupak uklanjanja vode je dehidracija u alkoholima rastuće jakosti (od 70 do 60%). Punjenje - čini tkaninu izdržljivom, sprječava gnječenje i gužvanje tijekom rezanja, omogućuje dobivanje rezova standardne debljine. Najčešći medij za ugradnju je parafin. Također se koriste celoidin, plastični mediji i smole. 33
Dehidracija priprema fiksirano tkivo za prodiranje medija za ugradnju. Voda iz živog tkiva, kao i voda iz smjesa za fiksiranje (većina fiksativa su vodene otopine) moraju se nakon fiksacije potpuno ukloniti. Standardni postupak za uklanjanje vode je dehidracija u alkoholima koji se povećavaju od 60° do 100°. 34
Punjenje je nužan postupak koji prethodi pripremi sekcija. Ispuna čini tkaninu izdržljivom, sprječava njeno gnječenje i gužvanje tijekom rezanja te omogućuje dobivanje tankih dijelova standardne debljine. Najčešći medij za ugradnju je parafin. Također se koriste celoidin, plastični mediji i smole. 35
Rotacijski mikrotom. 40 n Blokovi koji sadrže komad organa fiksirani su u držač pomičnog predmeta. Kada se spusti, serijski rezovi ostaju na nožu, uklanjaju se s noža i montiraju na predmetno staklo za daljnju obradu i mikroskopiranje.
Metode bojenja histosekcija: n Nuklearna (bazična): n hematoksilin - boji n n n n jezgre plavo; željezo hematoksilin; azur II (u ljubičastoj boji); karmin (u crvenoj boji); safranin (u crvenoj boji); metil plavo (u plavo); toluidin (u plavoj boji); tionin (u plavoj boji). n Citoplazmatski- (kiselina): n eozin - u ružičastoj boji; n eritrozin; n narančasto "G" ; n kiseli fuksin - do crvenog; n pikrinska kiselina - žuta; n Kongo - crveno - u crveno 44
SPECIJALNE metode bojenja histosekcija n Sudan III – narančasto bojenje lipida i masti; n osminska kiselina - bojanje lipida i masti u crno; n orcein - smeđe bojenje elastičnih vlakana; n srebrni nitrat - impregnacija živčanih elemenata u tamno smeđoj boji. 45
Stanične strukture: n OKSIFILA sposobnost bojenja u ružičasto kiselim bojama n Bazofilna sposobnost bojenja u plavo baznim bojama n Neutrofila - n sposobnost bojenja ljubičasto kiselim i bazičnim bojama. 47
1
Stanica n je elementarni živi sustav koji se sastoji od citoplazme, jezgre, membrane i osnova je razvoja, građe i života životinjskih i biljnih organizama.
Glikokaliks je epimembranski kompleks sastavljen od saharida vezanih na proteine i saharida vezanih na lipide. Funkcije n Recepcija (hormoni, citokini, medijatori i antigeni) n Međustanične interakcije (iritabilnost i prepoznavanje) n Parietalna probava (mikrovili crijevnih graničnih stanica)
Funkcije citoleme: - razgraničenje; - aktivni i pasivni transport tvari u oba smjera; - funkcije receptora; kontakt sa susjednim stanicama.
Glavni Objekti istraživanja su histološki preparati, a glavna metoda istraživanja je mikroskopija.
Histološki preparat treba biti dovoljno proziran (tanak) i kontrastan. Sastoji se od živih i mrtvih (fiksnih) struktura. Preparat može biti suspenzija stanica, bris, otisak, film, totalni preparat i rez.
Proces izrade histoloških preparata za mikroskopske studije uključuje sljedeće glavne korake: 1) uzimanje materijala i njegovo fiksiranje; 2) zbijenost materijala; 3) priprema sekcija; 4) bojenje ili kontrastne rezove; 5) zaključak odjeljaka.
Za bojenje se koriste posebne histološke boje s različitim pH vrijednostima: kiselim, neutralnim i bazičnim. Strukture obojene njima nazivaju se oksifilne, neutrofilne (heterofilne) odnosno bazofilne.
Koje metode koristi histološka znanost? Prilično su brojni i raznoliki:
Mikroskopija.
Svjetlosna mikroskopija. Moderni mikroskopi imaju visoku rezoluciju. Razlučivost je definirana kao najmanja udaljenost (d) između dvije susjedne točke koje se mogu vidjeti odvojeno. Ta udaljenost ovisi o valnoj duljini svjetlosti (λ) i izražava se formulom: d = 1/2 λ.
Minimalna valna duljina vidljivog dijela spektra je 0,4 µm. Stoga je moć razlučivosti svjetlosnog mikroskopa 0,2 µm, a ukupno povećanje doseže 2500 puta.
ultraljubičasta mikroskopija . Valna duljina ultraljubičastog svjetla je 0,2 µm, stoga je rezolucija ultraljubičastog mikroskopa 0,1 µm, ali budući da je ultraljubičasto zračenje nevidljivo, potreban je luminescentni zaslon za promatranje predmeta koji se proučava.
Fluorescentna (luminiscentna) mikroskopija. Kratkovalno (nevidljivo) zračenje, apsorbirano od strane niza tvari, pobuđuje njihove elektrone, koji emitiraju svjetlost veće valne duljine, postajući vidljivi dio spektra. Time se postiže povećanje razlučivosti mikroskopa.
Fazno kontrastna mikroskopija omogućuje emitiranje neobojenih objekata.
Polarizacijska mikroskopija koristi se za proučavanje arhitektonike histoloških struktura, kao što su kolagena vlakna.
elektronska mikroskopija omogućuje proučavanje objekata uvećanih desetke tisuća puta.
Mikrofotografija i mikrofilmografija . Ove metode omogućuju proučavanje nepokretnih objekata na fotografijama i živih mikroskopskih objekata u pokretu.
Metode kvalitativnog i kvantitativnog istraživanja.
Histo –i citokemija , uključujući kvantitativnu, omogućuje kvalitativnu analizu objekata koji se proučavaju na razini tkiva, stanica i substaničnih razina.
Citospekttrofotometrija Omogućuje proučavanje kvantitativnog sadržaja određenih bioloških tvari u stanicama i tkivima na temelju apsorpcije svjetlosti određene valne duljine od strane boje povezane s njima.
Diferencijalno centrifugiranje omogućuje odvajanje sadržaja stanica koje se međusobno razlikuju po svojoj masi.
Radiografija Temelji se na uključivanju radioaktivne oznake (na primjer, radioaktivnog joda, H³-timidina itd.) u metabolički proces.
Morfometrija omogućuje mjerenje površina i volumena stanica, njihovih jezgri i organela pomoću okulara i mikrometara za objekte i posebnih mreža.
Računalna aplikacija za automatsku obradu digitalnog materijala.
Metoda kulture tkiva je održavanje vitalnosti i dioba stanica i tkiva izvan tijela. Za to se koriste posebni spremnici s hranjivim medijem u kojima se stvaraju svi potrebni uvjeti za vitalnu aktivnost stanica. Pomoću ove metode moguće je proučavati diferencijaciju i funkcionalni razvoj stanica, obrasce njihove maligne transformacije i razvoj tumorskog procesa, međustanične interakcije, oštećenja stanica i tkiva virusima i mikroorganizmima, učinak lijekova na metabolizam. procesi u stanicama i tkivima itd.
Intravitalno (vitalno) bojenje koristi se za proučavanje fenomena fagocitoze i aktivnosti makrofaga, filtracijske sposobnosti bubrežnih tubula itd.
Metoda transplantacije tkiva. Ovom se metodom proučava ponašanje stanica i njihovo morfofunkcionalno stanje kada se transplantiraju u drugi organizam. Na primjer, ova metoda se koristi za držanje životinja izloženih smrtonosnim dozama zračenja.
Mikromanipulacija. Ova se metoda koristi u molekularnoj biologiji, genetičkom inženjerstvu, a također iu kloniranju, kada se mikromanipulatorom iz jajne stanice s haploidnim skupom kromosoma ukloni jezgra i u nju presadi jezgra somatske stanice s diploidnim skupom kromosoma.
postoji mnoge metode istraživanja, među kojima se ističu: promatranje živih embrija pomoću filmskog i video zapisa (koristi se uglavnom u eksperimentu). Za to se koristi poseban mikrofotografski uređaj koji je povezan s toplinskom komorom u kojoj se razvija embrij. Proučavajući razvoj kokošjeg embrija, primjerice, napravite prozor u ljusci koji se zatvori prozirnom pločom. Ova metoda omogućila je praćenje i pročišćavanje dinamike promjena oblika i veličine embrija u procesu razvoja.
Metoda fiksnog rezanja embrija pomoću svjetlosne i elektronske mikroskopije, historautografija, histo- i imunocitokemija. Ove metode omogućuju analizu tkiva i unutarstaničnih promjena u dinamici razvoja dijelova embrija. Uz pomoć histo- i imunocitokemijskih metoda proučavaju se biokemijski procesi koji se odvijaju u embrionalnim stanicama - sinteza DNA, RNA, proteina, specifičnih receptorskih proteina itd. Korištenjem ovih metoda dobivene su važne informacije o diferencijaciji stanica i tkiva u razvoju embrija i fetusa.
Metoda označavanja, koju je 1925. predložio W. Vogt (1888-1941), omogućuje proučavanje kretanja stanica u embriju u razvoju. Da bi se to postiglo, koriste se markeri koji nisu toksični za embrije (na primjer, neutralna crvena, čestice ugljena), kao i antitijela na određene proteine. Pri korištenju protutijela koristi se njihova sposobnost spajanja s fluorescentnom bojom i proteinima klice. Uz pomoć fluorescentne mikroskopije prati se raspodjela boje i proučava dinamika sinteze proteina u tkivima embrija u razvoju.
Mikrokirurške metode razvili su početkom 20. st. predstavnici škole G. Spemanna (1869.-1941.). One su uključivale: uklanjanje ljuski životinjskih jaja, transplantaciju dijelova jednog embrija u drugi, itd. Ove metode se također koriste za proučavanje posljedica uništavanja (na primjer, pomoću laserske zrake) dijelova embrija ili njegovih pojedinačnih Stanice. Transplantacija kao vrsta mikrokirurgije koristi se za utvrđivanje putova migracije stanica i izvora razvoja tkiva. U isto vrijeme, mjesto embrija, na primjer, prepelica, presađuje se na isto mjesto kokošjeg embrija umjesto udaljenog mjesta. Stanične jezgre prepelice imaju karakterističnu strukturu i stoga se razlikuju od jezgri stanica kokošjih embrija.
eksplantacija- izrezivanje malog područja embrija i njegov uzgoj u umjetnom okruženju. Pomoću ove metode moguće je dobiti informacije o izvorima razvoja tkiva iz određenog područja embrija i identificirati histogenetske obrasce razvoja.
Nuklearna transplantacija- metoda za kloniranje embrija. Na primjer, transplantacija jezgri iz stanica crijevnog epitela punoglavca žabe s pandžama u jaje žabe, čija je jezgra bila inaktivirana ultraljubičastom zrakom, dovela je do pojave novih jedinki (Gerdonovi pokusi). Ti su pokusi postavili temelje za kloniranje viših kralježnjaka i pridonijeli pojavi (1997.) poznate ovce Dolly. Slični embriološki pokusi uvjerljivo su pokazali da jezgre somatskih stanica sadrže kompletan skup genetskih informacija za razvoj novog organizma.
Najnovije postignuće eksperimentalna embriologija bio je razvoj metode in vitro oplodnje. Transplantacija embrija začetih in vitro u maternicu temelj je liječenja neplodnosti. Godine 1973. L. Shettles (SAD) izvadio je predovulacijsku jajnu stanicu iz jajnika neplodne žene i oplodio je spermijem njezina muža. To je bio početak tehnike presađivanja ljudskih embrija u svrhu liječenja neplodnosti. Međutim, tek 1978. godine u Velikoj Britaniji, kao rezultat uspješnog presađivanja u maternicu neplodne žene ljudskog embrija u fazi 8 blastomera, nakon 2,5 dana uzgoja, prvo dijete u svijetu iz "epruvete" vagano je Pojavilo se 2700 g.