Métodos de pesquisa histológica são usados para estudar a estrutura e função de células e tecidos de humanos, animais e plantas em condições normais, patológicas e experimentais. A base de G. m. e. é - um conjunto de técnicas metodológicas utilizadas na fabricação de preparações de células e tecidos para seu exame microscópico. O estudo microscópico de células e tecidos pode ser realizado de duas maneiras principais, dependendo do estado do objeto em estudo: o estudo de células e tecidos vivos, o estudo de células não vivas e tecidos que retêm sua estrutura devido à fixação especial técnicas. O estudo dos objetos vivos - vitais (supravital) - permite observar os processos fisiológicos nas células e tecidos, sua estrutura intravital. É realizado em células suspensas livremente em meio líquido (células sanguíneas, células epiteliais de raspagens, etc.), bem como em culturas de células e tecidos cultivadas em meios nutrientes especiais. O objeto da observação intravital pode ser filmes de tecido finos e transparentes (membrana de natação). Em estudos experimentais, são utilizados o método de janelas biológicas (implantação de câmaras transparentes) e o estudo de implantes teciduais em ambiente natural transparente, por exemplo, na câmara anterior do olho de animais. Dependendo da tarefa em mãos, vários métodos especiais de microscopia são usados em estudos vitais: campo escuro, contraste de fase, fluorescência, polarização, ultravioleta. Os métodos histológicos vitais são usados principalmente para pesquisas biológicas e biomédicas. Seu uso generalizado é limitado por grandes dificuldades técnicas associadas às propriedades dos tecidos sobreviventes. Na pesquisa médica, especialmente na prática de laboratórios de anatomia patológica, são utilizados métodos de estudo de objetos fixos. O objetivo da fixação é preservar a estrutura intravital das células e tecidos, expondo-os rapidamente a agentes químicos que impedem o desenvolvimento de alterações post-mortem. A escolha do método de fixação depende dos objetivos do estudo e das características do material a ser fixado. Assim, misturas fixadoras contendo sais de metais pesados (por exemplo, sublimados) são utilizadas para identificar estruturas celulares finas.O melhor fixador para fins citológicos é o tetróxido de ósmio, que é muito utilizado em microscopia eletrônica. Um fixador universal é o formaldeído, usado na forma de uma solução de formol a 10%. Para serem uniformes e completos, os pedaços de tecido devem ser pequenos e o volume do líquido fixador deve ser muitas vezes maior que o volume do material a ser fixado. Após a fixação, as peças geralmente são lavadas em água ou álcool. Componentes de tecido sólido (por exemplo, depósitos de cálcio) são removidos usando técnicas de descalcificação. A maneira mais rápida e fácil de preparar uma seção de tecido, geralmente usada em diagnósticos expressos, é um pedaço e obter seções de tecido em um micrótomo de congelamento. No entanto, é difícil obter cortes suficientemente finos, bem como cortes de pequenos objetos e tecidos em decomposição. Portanto, pedaços de tecido, como regra, são despejados em meios de vedação - ou celoidina. O fixo é desidratado em álcoois de força crescente, passado por um solvente intermediário (xileno ou parafina, álcool-éter para celoidina) e impregnado com parafina ou celoidina. em parafina permite obter seções mais finas (de 5-8 a 1-2 mícron) do que a celoidina. As seções para exame microscópico são preparadas usando uma lâmina ou micrótomo rotativo. Seções ultrafinas (espessura de 90-100 a 5-15 nm) necessários para estudos de microscopia eletrônica são preparados em um ultratome. Ultratomes também são usados em microscopia de luz para obter seções semi-finas. As seções preparadas são coradas para destacar claramente as estruturas das células e tecidos que percebem os corantes de maneira diferente. Os principais corantes - bases corantes e seus sais (azul de toluidina, azure, marrom bismarck) - coram as chamadas estruturas basofílicas (núcleos celulares, tecido conjuntivo). Corantes ácidos - ácidos corantes e seus sais (ácido pícrico, eritrosina) - coram estruturas acidófilas ou oxifílicas (citoplasma celular, colágeno, fibras elásticas). a coloração deve ser distinguida pela impregnação - um método especial baseado em certas áreas de células e tecidos para restaurar metais pesados (por exemplo, prata, ouro, ósmio) de seus sais e, assim, adquirir uma cor intensa. A preparação de um preparo histológico é completada pela colocação em meios que garantem a preservação das estruturas do objeto, sua cor e transparência. Na maioria das vezes, resinas orgânicas são usadas para esses fins, por exemplo.
1. Pequena enciclopédia médica. - M.: Enciclopédia Médica. 1991-96 2. Primeiros socorros. - M.: Grande Enciclopédia Russa. 1994 3. Dicionário enciclopédico de termos médicos. - M.: Enciclopédia Soviética. - 1982-1984.
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Livros
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Os objetos de estudo podem ser células e tecidos fixos (mortos) ou vivos.
Para estudar a microestrutura de matérias-primas e produtos pecuários, como regra, são utilizadas células e tecidos fixos. As preparações são temporárias, destinadas a um único estudo, e permanentes, que podem ser armazenadas e examinadas repetidamente. Além disso, preparações totais ou inteiras são usadas.
Drogas temporárias pode ser cozinhado de forma relativamente rápida; para isso, o material em estudo é fixado e os cortes são obtidos em micrótomo de congelamento; na sua ausência, um fino corte de tecido ou órgão pode ser feito com bisturi ou lâmina. O corte resultante é corado, colocado sobre uma lâmina de vidro e, em seguida, uma gota de glicerina é aplicada e coberta com uma lamínula. Para detectar o amido, é utilizada uma solução de iodo em iodeto de potássio: 0,5 g de iodeto de potássio é dissolvido em uma pequena quantidade de água, 1 g de iodo cristalino é adicionado e água é adicionada a 100 cm3. Algumas gotas de reagente são aplicadas em um pedaço fino de salsicha, queijo e outro material localizado em uma lâmina de vidro, o amido fica azul-violeta.
Preparações Totais ou Inteiras examinado sem obter uma seção de um tecido ou órgão. Por exemplo, um filme de tecido subcutâneo ou uma preparação esmagada de uma raiz de planta após a fixação, lavagem e coloração é colocado entre uma lâmina e uma lamela. Para identificar elementos estruturais individuais, pedaços fixos e corados de tecido subcutâneo ou tecido muscular liso são arrancados com uma agulha em uma lâmina de vidro - tais preparações são chamadas de arrancadas. Em alguns casos, por exemplo, ao examinar o filme da retina do globo ocular ou a pele de um girino, após a fixação e lavagem, a coloração não é realizada, pois as células contêm inclusões orgânicas (pigmento) de cor natural.
Método de preparação de uma preparação histológica. O principal método para estudar células e tecidos fixos é histológico, ou seja, estudo de uma seção de tecido corado fechado em um meio especial. Para a obtenção dos cortes, utiliza-se o derramamento do material de teste em parafina ou celoidina, o que possibilita a obtenção de cortes finos (5-7 mícrons ou 10-30 mícrons, respectivamente), para preparação rápida de cortes (40-60 mícrons), congelamento técnica é usada.
As principais etapas na preparação de um espécime histológico são: amostragem, fixação, lavagem, desidratação, inclusão em parafina ou celoidina, coloração, colocação sob lamínula.
Seleção de amostraé feito levando em consideração o objetivo do estudo e a estrutura do material. O tamanho da amostra não deve exceder 2,5-3,0 cm em média. As amostras de fígado e baço são colhidas com uma cápsula. Partes do átrio são recortadas do coração, pois as membranas são mais finas do que nos ventrículos e em uma preparação pode-se ver a relação topográfica do epicárdio, miocárdio e endocárdio. Dos rins, linfonodos, glândulas supra-renais, seções de órgãos são cortadas que vão profundamente na superfície perpendicular à superfície para que o córtex e a medula sejam revelados na preparação. Se for necessário preparar preparações de órgãos alterados, pedaços do material de teste são recortados na borda com a área afetada para que a zona de transição da lesão seja incluída na amostra. Amostras de músculos esqueléticos devem ser cortadas de modo que as fibras musculares fiquem em cortes longitudinais e transversais. Amostras de amostras de carne picada, queijo cottage e outras amostras em ruínas são colocadas primeiro em um pedaço de gaze e amarradas com um fio. Deve-se ter em mente que, ao abrir a cavidade torácica, os pulmões colapsam devido à elasticidade, perdendo significativamente a leveza; portanto, um tubo de vidro ou borracha é inserido na traqueia dos órgãos respiratórios extraídos, através do qual o ar é injetado moderadamente . Uma ligadura de seda é aplicada à traqueia abaixo do tubo inserido e uma carga é amarrada para imersão completa. Para fixar os intestinos, uma seção do órgão destinada à fixação é preliminarmente enfaixada com ligaduras em ambos os lados. As amostras são fornecidas com etiquetas de papel grosso indicando o número e a data da amostragem.
fixação, Essa. a preservação da arquitetura natural (durante a vida) é realizada para transferir o protoplasma vivo das estruturas para um estado imutável. O efeito dos fixadores se manifesta no fato de que, como resultado de processos biofísicos, ocorre coagulação irreversível de proteínas em tecidos e órgãos. A amostra de tecido retirada do órgão é imersa no fixador o mais rápido possível; a relação entre o volume do material e o líquido de fixação deve ser de pelo menos 1:9 (Fig. 3).
A fixação leva a alguma compactação e a uma diminuição do volume da amostra. Na maioria das vezes, 10-12% de formalina, álcool etílico e acetona são usados para fixação. Para preparar a concentração indicada do fluido fixador, formol a 40% é diluído com água da torneira. O álcool etílico (100% absoluto, ou 96%) é usado nos casos em que é necessário identificar substâncias que se dissolvem em fixadores aquosos (por exemplo, glicogênio) em cortes. Na acetona, o material em estudo (por exemplo, o cérebro) é fixado por apenas algumas horas. Quando o órgão em estudo, como tecido ósseo, contém cal, é realizada descalcificação ou calcificação. Para fazer isso, um pequeno pedaço de osso é abaixado (é melhor pendurá-lo em um fio) em uma solução aquosa de ácido nítrico a 5-8%, que é trocada 2-3 vezes ao dia. O resultado da descalcificação é avaliado cravando uma agulha fina no osso: se não houver resistência, a descalcificação está concluída. Após tal pro-
ruboré realizada para remover uma quantidade excessiva de fixador, por exemplo, após a fixação com formol, a lavagem é realizada com água corrente da torneira.
Desidratação realizada para compactar o material em álcool etílico de concentração crescente: 50-70-100. Para preparar álcool 50% e 70%, o álcool 96% é diluído com água destilada. Para preparar álcool 100%, é necessário aquecer o sulfato de cobre até a completa desidratação e adicionar álcool etílico 96% ao pó branco desidratado. Em cada concentração de álcool, o material é mantido por 1-24 horas, dependendo do tamanho das peças, da estrutura do órgão; em álcool 70%, o material pode ser guardado por vários dias.
encheré realizado em um meio tal que a amostra de teste se torna sólida, o que permite obter seções finas. Para fazer isso, use parafina (impregnação por 1-4 horas), celoidina (impregnação por três semanas). Ao revelar gorduras e para o estudo de tecidos e órgãos soltos, é usado despejar em gelatina.
fatias receber em trenó ou micrótomos rotacionais. As seções mais finas (5-7 mícrons) podem ser feitas de um material embebido em parafina. Seções de 15-20 mícrons de espessura são preparadas a partir do material preenchido com celoidina. Para estudar a microestrutura de matérias-primas e produtos de origem animal, como regra, é utilizada uma técnica de congelamento. Isso agiliza a preparação da preparação, pois elimina longas etapas de desidratação e vazamento. Após a fixação e lavagem, as peças do objeto são colocadas em um estágio úmido de um micrótomo de congelamento e são obtidos cortes com espessura de 40-60 μm. As seções são transferidas com um pincel para dentro da água, onde se endireitam, adquirindo a aparência dos fiapos mais finos e acinzentados.
Coloração de seção realizado para aumentar o contraste de várias estruturas em preparações destinadas ao exame em um microscópio de luz. No processo de coloração, ocorrem processos químicos e físicos complexos, portanto, ao escolher um método, é levada em consideração a afinidade seletiva das estruturas celulares por determinados corantes com diferentes propriedades físico-químicas.
Existem corantes básicos (basais), ácidos e especiais. Estruturas coradas com corantes básicos são chamadas de basofílico, corantes ácidos - oxifílica, acidófila, eosinofílica.
Dos corantes básicos (basais), utiliza-se a hematoxilina, que cora a cromatina do núcleo e outras estruturas contendo proteína em azul ou roxo; carmim, colorindo o núcleo em vermelho claro, safranina - tinta vermelha escura, tionina - tinta azul.
Dos corantes ácidos, utiliza-se a eosina (mancha o citoplasma de rosa), ácido pícrico (amarelo), fucsina (cor de tijolo), índigo carmim (azul).
Ao estudar a microestrutura de matérias-primas e produtos pecuários, a coloração combinada com hematoxilina e eosina é mais frequentemente usada. Para fazer isso, as seções da água são transferidas por 1-3 minutos para uma solução de hematoxilina; Lavado em água por 20-30 minutos, colocado em solução de eosina por 3-5 minutos e lavado com água por 3-5 minutos. A água restante é removida com papel de filtro, uma gota de etanol 96% é aplicada por 1-2 minutos e desidratada em uma solução de ácido carbólico a 25% em xileno ou tolueno. Em seguida, 1-2 gotas de bálsamo são aplicadas no corte e cobertas com uma lamela.
Dos corantes que colorem as inclusões gordurosas, o Sudan 111 é frequentemente usado. estar contido em excesso). A mistura é aquecida a 50% C e filtrada. Os cortes obtidos em um micrótomo de congelamento são colocados em etanol a 50% por 1-2 minutos e depois em Sudan III por 25 minutos. Os cortes são lavados em álcool 50%, lavados com água destilada e embebidos em glicerol-gelatina.
Gotas de gordura neutra ficam alaranjadas devido à dissolução de Sudan III em gorduras. As inclusões de gordura também podem ser detectadas com ácido ósmico, enquanto as estruturas gordurosas são coradas de preto.
Conclusão sob a lamínula realizada em ambientes que não permitem a passagem do ar e que consigam manter o corte por muito tempo. Os cortes corados são desidratados em álcoois de força crescente e colocados sob uma lamínula em abeto, bálsamo canadense ou glicerol-gelatina (a preparação não deve entrar em contato com álcoois e xilenos).
Preparação de preparações para microscopia eletrônica. Para estudar objetos biológicos, são utilizados dois tipos de microscópios eletrônicos: transmissão (transmissão) e varredura (raster).
O princípio de processamento de um objeto para exame em um microscópio eletrônico de transmissão é baseado nos mesmos princípios dos microscópios ópticos: amostragem, fixação, lavagem, desidratação, vazamento, preparação de cortes ultrafinos, contraste.
Seleção de amostraé realizado levando em consideração o objetivo do estudo e a estrutura do material, obedecendo às mesmas regras da microscopia de luz. O volume das peças do material estudado não deve ultrapassar 1 mm 3 . O principal objetivo da fixação é manter o tecido o mais próximo possível da vida.
FixaçãoÉ realizado para melhor preservação das estruturas, portanto, é necessário o uso de reagentes com certo pH e isotonicidade, cujos valores são determinados pelo tipo de tecido que está sendo fixado. O processo de fixação é realizado em duas etapas: prefixação e pós-fixação. Para a prefixação, é utilizada uma solução de glutaraldeído a 2,5-3% (pH 7,2-7,4), a duração da fixação é de 2-4 horas. A pós-fixação é realizada em solução a 2% (pH 7,2-7,4) - 1- 2 horas Para preservar a estrutura intravital, recomenda-se usar um fixador de baixa temperatura (0-4 °C) e preparar fixadores em soluções de tampão fosfato, cacodilato, acetato de veronal.
ruboré realizado com 30% de álcool frio 5-7 vezes, o objeto é mantido em cada porção de álcool por 30 minutos, ou seja, lavado do fixador para tal estado quando a ação oxidante do fixador cessa.
Desidratação realizar com álcoois etílicos de força crescente: 30, 50, 70, 96, 100% por 30 minutos. Para alguns métodos de vazamento, a adição de acetona e óxido de propileno é recomendada para desaguamento.
encher realizado em resinas epóxi (araldite, epon, etc.). A polimerização de resinas em cápsulas é realizada em um termostato a 60 °C até o endurecimento, como regra, dentro de 1-2 dias.
Seções ultrafinas são obtidos usando facas de vidro em um ultramicrótomo; para isso, blocos de epóxi são afiados na forma de uma pirâmide truncada tetraédrica. Seções seriadas acinzentadas são colocadas em um banho com 10% de etanol. As seções resultantes são montadas em malhas de cobre ou paládio, na superfície das quais um filme de formvar é aplicado preliminarmente. Para revelar as estruturas necessárias, os cortes nas telas são tratados com soluções de citrato de chumbo e acetato de uranila.
Por microscopia eletrônica de varredura a amostra de teste é fixada, desidratada, dependendo do objetivo do estudo, usando os fixadores acima. Após a desidratação, a amostra é colada em um objeto suporte, colocada em uma unidade de pulverização e revestida com uma camada muito fina de ouro ou platina. Ao contrário da microscopia eletrônica de transmissão, a microscopia eletrônica de varredura pode usar preparações corrosivas: o objeto de estudo é derramado com algumas substâncias endurecedoras e, em seguida, os moldes e as superfícies são examinados. Eles também estudam réplicas obtidas por congelamento - chipping. Neste caso, é examinada uma impressão da clivagem da superfície do objeto. Para aumentar o contraste, as réplicas devem ser sombreadas por pulverização de partículas metálicas (ouro, platina) ou carvão.
perguntas do teste
- 1. Que métodos são utilizados no estudo das estruturas celulares, tecidos e órgãos?
- 2. Quais são as regras básicas a serem seguidas na coleta de amostras para a preparação de preparações histológicas?
- 3. Quais são as características da preparação de preparações de tecido ósseo?
- 4. Como o material de teste é fixado?
- 5. O que é usado para desidratação de preparações?
- 6. Quais meios são usados para derramar o material de teste?
- 7. Qual corante é usado para detectar tecido adiposo?
- 8. Qual é o método de corte mais usado e por quê?
- 9. Citar as principais etapas de preparação de espécimes para microscopia eletrônica de transmissão e varredura.
Histologia - ("gistos" em grego - tecido, logis - ensino) Esta é a ciência da estrutura, desenvolvimento e atividade vital dos tecidos de organismos multicelulares e humanos. Os objetos que são objeto desta ciência são inacessíveis a olho nu. Portanto, a história da histologia está intimamente ligada à história da criação de tais instrumentos que nos permitem estudar os menores objetos a olho nu. 2
O curso de histologia é convencionalmente dividido nas seguintes seções: n 1. Citologia é a ciência da célula. n 2. Embriologia é a ciência do desenvolvimento, desde o início até a formação completa de um organismo. n 3. Histologia geral - a ciência dos padrões gerais inerentes aos tecidos. n 4. Histologia privada - estuda a estrutura, desenvolvimento de órgãos e sistemas.
CITOLOGIA - (grego κύτος "célula" e λόγος - "estudo", "ciência") n Ramo da biologia que estuda as células vivas, suas organelas, sua estrutura, funcionamento, processos de reprodução celular, envelhecimento e morte. quatro
EMBRIOLOGIA n (de outro -grego ἔμβρυον - embrião, embrião + -λογία de λόγος - ensino) é uma ciência que estuda o desenvolvimento do embrião. 5
A história da criação da teoria celular 1590. Jansen inventou o microscópio, no qual a ampliação era fornecida pela conexão de duas lentes. 1665. Robert Hooke usou pela primeira vez o termo célula. 1650-1700 anos. Anthony van Leeuwenhoek descreveu pela primeira vez bactérias e outros microrganismos. 1700 -1800 anos. Muitas novas descrições e desenhos de vários tecidos, principalmente vegetais, foram publicados. Em 1827 Karl Baer descobriu o ovo em mamíferos. 1831 -1833 anos. Robert Brown descreveu o núcleo em células vegetais. 1838 -1839 anos. O botânico Matthias Schleiden e o zoólogo Theodor Schwann combinaram as ideias de diferentes cientistas e formularam a teoria celular, que postulava que a unidade básica de estrutura e função nos organismos vivos é a célula. 1855 Rudolf Virchow mostrou que todas as células são formadas como resultado de divisões celulares.
A história da criação da teoria celular 1665. Examinando uma seção de cortiça ao microscópio, um cientista inglês, o físico Robert Hooke descobriu que ela consiste em células separadas por partições. Essas células ele chamou de "células"
A história da criação da teoria celular No século 17, Leeuwenhoek projetou um microscópio e abriu a porta do microcosmo para as pessoas. Uma variedade de ciliados, rotíferos e outras pequenas criaturas vivas passaram diante dos olhos dos pesquisadores atônitos. Descobriu-se que eles estão em toda parte - esses organismos menores: na água, no esterco, no ar e na poeira, na terra e nas sarjetas, nos resíduos apodrecidos de origem animal e vegetal.
A história da criação da teoria celular 1831-1833. Robert Brown descreveu o núcleo em células vegetais. Em 1838, o botânico alemão M. Schleiden chamou a atenção para o núcleo e o considerou o originador da célula. De acordo com Schleiden, um nucléolo se condensa a partir de uma substância granular, ao redor da qual um núcleo é formado e ao redor do núcleo - uma célula, e o núcleo pode desaparecer no processo de formação da célula.
A história da criação da teoria celular O zoólogo alemão T. Schwann mostrou que os tecidos animais também consistem em células. Ele criou uma teoria afirmando que as células contendo núcleos representam a base estrutural e funcional de todos os seres vivos. A teoria celular da estrutura foi formulada e publicada por T. Schwann em 1839. Sua essência pode ser expressa nas seguintes disposições: 1. A célula é a unidade estrutural elementar da estrutura de todos os seres vivos; 2. As células de plantas e animais são independentes, homólogas entre si em origem e estrutura. Cada célula funciona independentemente das outras, mas em conjunto com todas. 3. Todas as células surgem de uma substância intercelular sem estrutura. (Erro!) 4. A atividade vital da célula é determinada pela casca. (Erro!)
A história da criação da teoria celular Em 1855, o médico alemão R. Virchow fez uma generalização: uma célula só pode surgir de uma célula anterior. Isso levou à percepção do fato de que o crescimento e o desenvolvimento dos organismos estão associados à divisão celular e sua diferenciação posterior, levando à formação de tecidos e órgãos.
A história da criação da teoria celular Karl Baer Em 1827, Karl Baer descobriu o ovo em mamíferos, provou que o desenvolvimento dos mamíferos começa com um ovo fertilizado. Isso significa que o desenvolvimento de qualquer organismo começa com um óvulo fertilizado, a célula é a unidade de desenvolvimento.
A história da criação da teoria celular 1865 Publicam-se as leis da hereditariedade (G. Mendel). 1868 Os ácidos nucleicos foram descobertos (F. Miescher) 1873 Os cromossomos foram descobertos (F. Schneider) 1874 A mitose foi descoberta em células vegetais (I. D. Chistyakov) 1878 A divisão mitótica de células animais foi descoberta (W. Fleming, P. I. Peremezhko) 1879 Fleming - o comportamento dos cromossomos durante a divisão. 1882 A meiose foi descoberta em células animais (W. Fleming) 1883 Foi demonstrado que o número de cromossomos em células germinativas é duas vezes menor do que em células somáticas (E. Van Beneden) 1887 A meiose foi descoberta em células vegetais (E. Strasburger) 1898 Golgi descobriu o aparelho de malha da célula, o aparelho de Golgi. 1914 A teoria cromossômica da hereditariedade foi formulada (T. Morgan). 1924 A teoria natural-científica da origem da vida na Terra foi publicada (A. I. Oparin). 1953 As idéias sobre a estrutura do DNA foram formuladas e seu modelo foi criado (D. Watson e F. Crick). 1961 A natureza e as propriedades do código genético são determinadas (F. Crick, L. Barnet, S. Benner).
As principais disposições da teoria celular moderna 1. Uma célula é um sistema vivo elementar, uma unidade de estrutura, atividade vital, reprodução e desenvolvimento individual dos organismos. 2. As células de todos os organismos vivos são homólogas, uniformes em estrutura e origem. 3. Formação celular. Novas células surgem apenas pela divisão de células pré-existentes. 4. Célula e organismo. Uma célula pode ser um organismo independente (procariontes e eucariotos unicelulares). Todos os organismos multicelulares são constituídos por células. 5. Funções das células. Nas células, são realizados metabolismo, irritabilidade e excitabilidade, movimento, reprodução e diferenciação. 6. Evolução celular. A organização celular surgiu no alvorecer da vida e percorreu um longo caminho de desenvolvimento evolutivo de formas livres de núcleo (procariontes) para formas nucleares (eucariotos).
MÉTODOS PARA MICROSCOPIA DE AMOSTRAS HISTOLÓGICAS 1. Microscopia de luz. 2. Microscopia ultravioleta. 3. Microscopia fluorescente (luminescente). 4. Microscopia de contraste de fase. 5. Microscopia de campo escuro. 6. Microscopia de interferência 7. Microscopia de polarização. 8. Microscopia eletrônica. 17
Microscópio n Este instrumento óptico permite observar pequenos objetos. A ampliação da imagem é conseguida por um sistema de lentes objetivas e uma ocular. O espelho, condensador e diafragma direcionam o fluxo de luz e regulam a iluminação do objeto. A parte mecânica do microscópio inclui: um tripé, uma mesa de objetos, parafusos de macro e micrômetros, um suporte de tubo. dezoito
Métodos especiais de microscopia: - microscópio de contraste de fase - (para o estudo de objetos vivos não manchados) - a microscopia permite estudar objetos vivos e não manchados. Quando a luz passa por objetos coloridos, a amplitude da onda de luz muda e quando a luz passa por objetos não coloridos, a fase da onda de luz muda, que é usada para obter uma imagem de alto contraste em microscopia de contraste de fase e interferência. - microscópio de campo escuro (para estudar objetos vivos não manchados). É usado um condensador especial que destaca as estruturas contrastantes do material não pintado. A microscopia de campo escuro permite observar objetos vivos. O objeto observado aparece como iluminado em um campo escuro. Nesse caso, os raios do iluminador incidem sobre o objeto pela lateral e apenas os raios dispersos entram nas lentes do microscópio. 19
Métodos especiais de microscopia Luminescent mic-p (para o estudo de objetos vivos não manchados) A microscopia é usada para observar objetos fluorescentes (luminescentes). Em um microscópio fluorescente, a luz de uma fonte poderosa passa por dois filtros. Um filtro bloqueia a luz na frente da amostra e permite que a luz do comprimento de onda que excita a amostra fluoresça. O outro filtro permite que a luz do comprimento de onda emitida pelo objeto fluorescente passe. Assim, objetos fluorescentes absorvem luz de um comprimento de onda e emitem luz em outra região do espectro. -capacidade ultravioleta m-pa) mic-p (aumenta a resolução -polarização mic-p (para objetos de pesquisa com um arranjo ordenado de moléculas - esqueleto, músculo, fibras de colágeno, etc.) microscopia - formação de imagens de estruturas anisotrópicas sem cor (como como fibras de colágeno e miofibrilas).20
Métodos especiais de microscopia - microscopia de interferência (para determinar o resíduo seco nas células, determinar a espessura dos objetos) - a microscopia combina os princípios da microscopia de contraste de fase e de polarização e é usada para obter uma imagem de contraste de objetos não manchados. Óptica de interferência especial (óptica Nomarsky) encontrou aplicação em microscópios com contraste de interferência diferencial. C. Microscopia eletrônica: -transmissão (estudo dos objetos através da transmissão) -varredura (estudo da superfície dos objetos) Teoricamente, a resolução de uma transmissão EM é de 0,002 nm. A resolução real dos microscópios modernos se aproxima de 0,1 nm. Para objetos biológicos, a resolução EM na prática é de 2 nm. 21
Técnicas Especiais de Microscopia Um microscópio eletrônico de transmissão consiste em uma coluna através da qual os elétrons emitidos por um filamento catódico passam no vácuo. Um feixe de elétrons focalizado por ímãs de anel passa pela amostra preparada. O caráter de espalhamento de elétrons depende da densidade da amostra. Os elétrons que passam pela amostra são focalizados, observados em uma tela fluorescente e registrados por meio de uma chapa fotográfica. Um microscópio eletrônico de varredura é usado para obter uma imagem tridimensional da superfície de um objeto em estudo. O método de chipping (congelamento-clivagem) é usado para estudar a estrutura interna das membranas celulares. As células são congeladas à temperatura de nitrogênio líquido na presença de um crioprotetor e usadas para fazer chips. Os planos de clivagem passam pelo meio hidrofóbico da bicamada lipídica. A superfície interna exposta das membranas é sombreada com platina, as réplicas resultantes são estudadas em um EM de varredura. 22
Métodos especiais (não microscópicos): 1. Cito- ou histoquímica - a essência é o uso de reações químicas estritamente específicas com um produto final leve nas células e tecidos para determinar a quantidade de várias substâncias (proteínas, enzimas, gorduras, carboidratos, etc.). Pode ser aplicado ao nível de um microscópio de luz ou eletrônico. 2. Citofotometria - o método é utilizado em combinação com 1 e permite quantificar proteínas, enzimas, etc. identificadas pelo método cito-histoquímico 3. Autorradiografia - substâncias contendo isótopos radioativos de elementos químicos são introduzidas no organismo. Essas substâncias estão incluídas em processos metabólicos nas células. Localização, movimento adicional dessas substâncias nos órgãos são determinados em preparações histológicas por radiação, que é capturada por uma emulsão fotográfica aplicada à preparação. 4. Análise de difração de raios X - permite determinar a quantidade de elementos químicos nas células, para estudar a estrutura molecular de micro-objetos biológicos. 24 5. Morfometria - medição do tamanho do biol. estruturas nos níveis celular e subcelular.
Métodos especiais (não microscópicos) 6. Microurgia - realizar operações muito delicadas com um micromanipulador ao microscópio (transplante de núcleos, introdução de várias substâncias nas células, medição de biopotenciais, etc.) 6. Método de cultivo de células e tecidos - em meios nutrientes ou em câmaras de difusão, implantados em vários tecidos do corpo. 7. Ultracentrifugação - fracionamento de células ou estruturas subcelulares por centrifugação em soluções de várias densidades. 8. Método experimental. 9. Método de transplante de tecidos e órgãos. 25
A fixação preserva a estrutura das células, tecidos e órgãos, previne sua contaminação bacteriana e digestão enzimática e estabiliza as macromoléculas por meio de sua reticulação química. 32
Fixação de formalina líquida, álcoois, glutaraldeído - Os fixadores mais comuns; Criofixação - A melhor preservação das estruturas é assegurada pelo congelamento instantâneo das amostras em nitrogênio líquido (-196°C); Liofilização - pequenos pedaços de tecido são submetidos a congelamento rápido, o que interrompe os processos metabólicos. Desidratação - o procedimento padrão para a remoção de água é a desidratação em álcoois de força crescente (de 70 a 60%). Enchimento - torna o tecido durável, evita que ele amassa e enrugue durante o corte, possibilita a obtenção de cortes de espessura padrão. O meio de incorporação mais comum é a parafina. Celoidina, meios plásticos e resinas também são usados. 33
A desidratação prepara o tecido fixado para a penetração do meio de incorporação. A água do tecido vivo, bem como a água das misturas fixadoras (a maioria dos fixadores são soluções aquosas) devem ser completamente removidas após a fixação. O procedimento padrão para a remoção de água é a desidratação em álcoois aumentando de 60° para 100° de força. 34
O preenchimento é um procedimento necessário que antecede a preparação das seções. O enchimento torna o tecido durável, evita que ele seja esmagado e enrugado durante o corte e permite obter seções finas de espessura padrão. O meio de incorporação mais comum é a parafina. Celoidina, meios plásticos e resinas também são usados. 35
Micrótomo rotativo. 40 n Blocos contendo um pedaço de órgão são fixados em um porta-objetos móvel. Quando abaixado, os cortes seriados permanecem na faca, são removidos da faca e montados em uma lâmina de vidro para posterior processamento e microscopia.
Métodos de coloração por histosecção: n Nuclear (básico): n hematoxilina - coloração n n n n núcleos com azul; hematoxilina de ferro; azur II (em roxo); carmim (em vermelho); safranina (em vermelho); azul de metilo (para azul); toluidina (em azul); tionina (em azul). n Citoplasmático- (ácido): n eosina - em rosa; n eritrosina; n laranja "G" ; n fuchsin azedo - para vermelho; n ácido pícrico - amarelo; n Congo - vermelho - a vermelho 44
Métodos ESPECIAIS para coloração de histosecções n Sudão III – coloração laranja de lipídios e gorduras; n ácido ósmico - coloração de lipídios e gorduras em preto; n orceína - coloração marrom das fibras elásticas; n nitrato de prata - impregnação de elementos nervosos em uma cor marrom escura. 45
Estruturas celulares: n OXYPHILIAn a capacidade de corar rosa com corantes ácidos n Basophilian a capacidade de corar azul com corantes básicos n Neutrofilia - n capacidade de corar roxo com corantes ácidos e básicos. 47
1
A célula n é um sistema vivo elementar que consiste em citoplasma, núcleo, membrana e é a base para o desenvolvimento, estrutura e vida de organismos animais e vegetais.
O glicocálice é um complexo epimembranar composto de sacarídeos ligados a proteínas e sacarídeos ligados a lipídios. Funções n Recepção (hormônios, citocinas, mediadores e antígenos) n Interações intercelulares (irritabilidade e reconhecimento) n Digestão parietal (microvilosidades das células da borda intestinal)
Funções do citolema: - delimitação; - transporte ativo e passivo de substâncias em ambas as direções; - funções do receptor; contato com células vizinhas.
Principal Objetos de pesquisa são preparações histológicas, e o principal método de pesquisa é a microscopia.
A preparação histológica deve ser suficientemente transparente (fina) e contrastante. É feito de estruturas vivas e mortas (fixas). A preparação pode ser uma suspensão de células, um esfregaço, uma impressão, um filme, uma preparação total e uma seção delgada.
O processo de confecção de preparações histológicas para estudos microscópicos inclui as seguintes etapas principais: 1) pegar o material e fixá-lo; 2) compactação do material; 3) preparação de seções; 4) coloração ou cortes contrastantes; 5) conclusão das seções.
Para coloração, são utilizados corantes histológicos especiais com diferentes valores de pH: ácido, neutro e básico. As estruturas coradas por eles são chamadas de oxifílicas, neutrofílicas (heterofílicas) e basofílicas, respectivamente.
Que métodos a ciência histológica usa? Eles são bastante numerosos e variados:
Microscopia.
Luz do microscópio. Os microscópios modernos têm alta resolução. A resolução é definida como a menor distância (d) entre dois pontos adjacentes que podem ser vistos separadamente. Esta distância depende do comprimento de onda da luz (λ) e é expressa pela fórmula: d = 1/2 λ.
O comprimento de onda mínimo da parte visível do espectro é de 0,4 µm. Portanto, o poder de resolução do microscópio de luz é de 0,2 µm e a ampliação total chega a 2500 vezes.
microscopia ultravioleta . O comprimento de onda da luz ultravioleta é de 0,2 µm, portanto, a resolução do microscópio ultravioleta é de 0,1 µm, mas como a radiação ultravioleta é invisível, é necessária uma tela luminescente para observar o objeto em estudo.
Microscopia fluorescente (luminescente). A radiação de ondas curtas (invisíveis), sendo absorvida por uma série de substâncias, excita seus elétrons, que emitem luz com comprimento de onda maior, tornando-se a parte visível do espectro. Assim, um aumento na resolução do microscópio é alcançado.
Microscopia de contraste de fase permite que você emita objetos sem cor.
Microscopia polarizadora usado para estudar a arquitetura de estruturas histológicas, como fibras de colágeno.
microscópio eletrônico torna possível estudar objetos ampliados dezenas de milhares de vezes.
Microfotografia e microfilmografia . Esses métodos permitem estudar objetos fixos em fotografias e objetos microscópicos vivos em movimento.
Métodos de pesquisa qualitativa e quantitativa.
História –e citoquímica , inclusive quantitativo, permite uma análise qualitativa dos objetos em estudo nos níveis tecidual, celular e subcelular.
Citoespectrofotometria Permite estudar o conteúdo quantitativo de certas substâncias biológicas em células e tecidos com base na absorção de luz de um determinado comprimento de onda pelo corante associado a elas.
Centrifugação diferencial permite separar o conteúdo das células que diferem umas das outras em sua massa.
Radiografia Baseia-se na inclusão de um marcador radioativo (por exemplo, iodo radioativo, H³-timidina, etc.) no processo metabólico.
Morfometria permite medir as áreas e volumes das células, seus núcleos e organelas usando ocular - e micrômetros de objetos e grades especiais.
Aplicativo de computador para processamento automático de material digital.
Método de cultura de tecidosé a manutenção da viabilidade e divisão de células e tecidos fora do corpo. Para isso, são utilizados recipientes especiais com meio nutriente, nos quais são criadas todas as condições necessárias para a atividade vital das células. Usando este método, é possível estudar a diferenciação e o desenvolvimento funcional das células, os padrões de sua transformação maligna e o desenvolvimento de um processo tumoral, interação intercelular, danos às células e tecidos por vírus e microorganismos, o efeito de drogas no metabolismo processos em células e tecidos, etc.
Coloração intravital (vital) usado para estudar os fenômenos de fagocitose e a atividade dos macrófagos, a capacidade de filtração dos túbulos renais, etc.
Método de transplante de tecidos. Este método é usado para estudar o comportamento das células e seu estado morfofuncional quando são transplantadas para outro organismo. Por exemplo, este método é usado para manter os animais expostos a doses letais de radiação.
Micromanipulação. Esse método tem sido usado em biologia molecular, engenharia genética e também na clonagem, quando um núcleo é removido de um óvulo com um conjunto haplóide de cromossomos usando um micromanipulador e um núcleo de célula somática com um conjunto diplóide de cromossomos é transplantado para ele.
Existe muitos métodos de pesquisa, dentre os quais se destacam: observação de embriões vivos por meio de filmagem e gravação de vídeo (usado principalmente no experimento). Para isso, é usado um dispositivo microfotográfico especial, que é conectado a uma câmara térmica na qual o embrião se desenvolve. Ao estudar o desenvolvimento de um embrião de galinha, por exemplo, você faz uma janela na casca, que é fechada com uma placa transparente. Esse método possibilitou rastrear e refinar a dinâmica das mudanças na forma e tamanho dos embriões no processo de desenvolvimento.
Método de fatia fixa embriões usando microscopia de luz e eletrônica, historradioautografia, histo e imunocitoquímica. Esses métodos permitem analisar as alterações teciduais e intracelulares na dinâmica de desenvolvimento de partes do embrião. Com a ajuda de métodos histo e imunocitoquímicos, são estudados processos bioquímicos que ocorrem em células embrionárias - a síntese de DNA, RNA, proteínas, proteínas receptoras específicas, etc. de embriões e fetos.
Método de marcação, proposto em 1925 por W. Vogt (1888-1941), permite estudar os movimentos celulares em um embrião em desenvolvimento. Para isso, são usados marcadores não tóxicos para os embriões (por exemplo, vermelho neutro, partículas de carvão), bem como anticorpos para determinadas proteínas. Ao usar anticorpos, sua capacidade de combinar com um corante fluorescente e proteínas germinativas é usada. Com a ajuda da microscopia fluorescente, a distribuição do corante é traçada e a dinâmica da síntese de proteínas nos tecidos em desenvolvimento do embrião é estudada.
Métodos de microcirurgia foram desenvolvidos no início do século 20 por representantes da escola de G. Spemann (1869-1941). Eles incluíam: remoção das cascas de ovos de animais, transplante de partes de um embrião para outro, etc. Esses métodos também são usados para estudar as consequências da destruição (por exemplo, usando um feixe de laser) de partes do embrião ou de seu células. O transplante como um tipo de microcirurgia é usado para identificar as vias de migração celular e fontes de desenvolvimento de tecidos. Ao mesmo tempo, um sítio do embrião, por exemplo, uma codorna, é transplantado no mesmo sítio do embrião de galinha no lugar do sítio remoto. Os núcleos de células de codorna têm uma estrutura característica e, portanto, são distinguíveis dos núcleos de células embrionárias de galinha.
explantação- excisão de uma pequena área do embrião e seu cultivo em ambiente artificial. Usando este método, é possível obter informações sobre as fontes de desenvolvimento tecidual de uma determinada área do embrião e identificar padrões histogenéticos de desenvolvimento.
Transplante nuclear- um método de clonagem de embriões. Por exemplo, o transplante de núcleos das células do epitélio intestinal do girino de rã com garras em um ovo de rã, cujo núcleo foi inativado por um raio ultravioleta, levou ao aparecimento de novos indivíduos (experiências de Gerdon). Esses experimentos lançaram as bases para a clonagem de vertebrados superiores e contribuíram para o surgimento (em 1997) da famosa ovelha Dolly. Experimentos embriológicos semelhantes mostraram de forma convincente que os núcleos das células somáticas contêm um conjunto completo de informações genéticas para o desenvolvimento de um novo organismo.
A mais recente conquista embriologia experimental foi o desenvolvimento do método de fertilização in vitro. O transplante de embriões concebidos em tubo de ensaio para o útero é a base do tratamento da infertilidade. Em 1973, L. Shettles (EUA) extraiu um óvulo pré-ovulatório do ovário de uma mulher infértil e o fertilizou com os espermatozóides do marido. Este foi o início da técnica de transplante de embriões humanos para tratar a infertilidade. No entanto, apenas em 1978 no Reino Unido, como resultado de um transplante bem sucedido no útero de uma mulher infértil de um embrião humano na fase de 8 blastômeros, após 2,5 dias de cultivo, a primeira criança "de proveta" do mundo pesando 2700 g apareceram.