Histologické metódy výskumu sa používajú na štúdium štruktúry a funkcie buniek a tkanív ľudí, zvierat a rastlín v normálnych, patologických a experimentálnych podmienkach. Základom G. m. a. je - súbor metodických techník používaných pri výrobe preparátov buniek a tkanív na ich mikroskopické vyšetrenie. Mikroskopické štúdium buniek a tkanív sa môže vykonávať dvoma hlavnými spôsobmi, v závislosti od stavu skúmaného objektu: štúdium živých buniek a tkanív, štúdium neživých buniek a tkanív, ktoré si zachovávajú svoju štruktúru vďaka špeciálnej fixácii. techniky. Štúdium živých predmetov - vitálnych (supravitálnych) - umožňuje sledovať fyziologické procesy v bunkách a tkanivách, ich intravitálnu štruktúru. Vykonáva sa na bunkách voľne suspendovaných v tekutom médiu (krvinky, epiteliálne bunky zo škrabancov atď.), ako aj na bunkových a tkanivových kultúrach pestovaných na špeciálnych živných médiách. Objektom intravitálneho pozorovania môžu byť tenké, priehľadné tkanivové filmy (plavecká membrána). V experimentálnych štúdiách sa využíva metóda biologických okien (implantácia priehľadných komôr) a štúdium tkanivových implantátov v prirodzenom priehľadnom prostredí, napríklad v prednej očnej komore zvierat. V závislosti od danej úlohy sa v životne dôležitých štúdiách používajú rôzne špeciálne mikroskopické metódy: tmavé pole, fázový kontrast, fluorescencia, polarizácia, ultrafialové žiarenie. Vitálne histologické metódy sa používajú najmä na biologický a biomedicínsky výskum. Ich široké využitie je obmedzené veľkými technickými ťažkosťami spojenými s vlastnosťami prežívajúcich tkanív. V lekárskom výskume, najmä v praxi laboratórií anatomickej patológie, sa používajú metódy štúdia pevných predmetov. Účelom fixácie je zachovať intravitálnu štruktúru buniek a tkanív ich rýchlym vystavením chemickým činidlám, ktoré bránia rozvoju posmrtných zmien. Výber spôsobu fixácie závisí od cieľov štúdie a vlastností materiálu, ktorý sa má fixovať. Na identifikáciu tenkých bunkových štruktúr sa teda používajú fixačné zmesi obsahujúce soli ťažkých kovov (napríklad sublimát), pričom najlepším fixátorom na cytologické účely je oxid osmičelý, ktorý sa často používa v elektrónovej mikroskopii. Univerzálnym fixátorom je formaldehyd, používaný vo forme 10% roztoku formalínu. Aby boli kusy tkaniva jednotné a úplné, musia byť malé a objem fixačnej kvapaliny musí byť mnohonásobne väčší ako objem fixovaného materiálu. Po fixácii sa kusy zvyčajne umyjú vo vode alebo alkohole. Pevné zložky tkaniva (napr. vápenaté usadeniny) sa odstraňujú pomocou techník odvápnenia. Najrýchlejší a najjednoduchší spôsob prípravy tkanivového rezu, ktorý sa zvyčajne používa v expresnej diagnostike, je kus a získanie tkanivových rezov na mraziacom mikrotóme. Je však ťažké získať dostatočne tenké rezy, ako aj rezy z malých predmetov a rozpadajúcich sa tkanív. Preto sa kúsky tkaniva spravidla nalejú do tesniaceho média - alebo celoidínu. Fixovaný sa dehydruje v alkoholoch so zvyšujúcou sa silou, prechádza cez prechodné rozpúšťadlo (xylén alebo pre parafín, alkohol-éter pre celoidín) a impregnuje sa parafínom alebo celoidínom. v parafíne vám umožňuje získať tenšie časti (od 5-8 do 1-2 mikrón) ako celoidín. Rezy na mikroskopické vyšetrenie sa pripravujú pomocou sklíčka alebo rotačného mikrotómu. Ultra tenké rezy (hrúbka od 90-100 do 5-15 nm) potrebné na elektrónové mikroskopické štúdie sa pripravujú na ultratóme. Ultratomy sa používajú aj vo svetelnej mikroskopii na získanie polotenkých rezov. Pripravené rezy sú zafarbené, aby sa zreteľne zvýraznili štruktúry buniek a tkanív, ktoré inak vnímajú farbivá. Hlavné farbivá - farbiace zásady a ich soli (toluidínová modrá, azúrová, bismarck hnedá) - farbia takzvané bazofilné štruktúry (bunkové jadrá, spojivové tkanivo). Kyslé farbivá – farbiace kyseliny a ich soli (kyselina pikrová, erytrozín) – farbia acidofilné, prípadne oxyfilné štruktúry (bunková cytoplazma, kolagén, elastické vlákna). farbenie by sa malo odlišovať impregnáciou - špeciálnou metódou založenou na určitých oblastiach buniek a tkanív na obnovenie ťažkých kovov (napríklad striebra, zlata, osmia) z ich solí, a tým získať intenzívnu farbu. Príprava histologického preparátu je ukončená jeho umiestnením do médií, ktoré zabezpečujú zachovanie štruktúr objektu, jeho farby a priehľadnosti. Najčastejšie sa na tieto účely používajú napríklad organické živice.
1. Malá lekárska encyklopédia. - M.: Lekárska encyklopédia. 1991-96 2. Prvá pomoc. - M.: Veľká ruská encyklopédia. 1994 3. Encyklopedický slovník medicínskych termínov. - M.: Sovietska encyklopédia. - 1982-1984.
Pozrite sa, čo sú "metódy histologického výskumu" v iných slovníkoch:
Metodické prístupy a metódy výskumu v anatómii človeka- Občas človek počúva, že v anatómii už nezostalo nič na štúdium, výskum, vraj sú všetky témy vyčerpané, všetko, čo sa dalo študovať, je už naštudované, všetky záležitosti sú vyriešené. Akoby všetko, čo sa týka stavby ľudského tela, ... ... Slovník pojmov a pojmov o ľudskej anatómii
LABORATÓRNY VÝSKUM- LABORATÓRNY VÝSKUM. pozri LABORATÓRNE ŠTÚDIE. Najdôležitejšou podmienkou pre získanie spoľahlivých výsledkov výskumu je správny výber objektov analýzy, ich včasný výber a formulácia výskumného problému. Pravidlá vzorkovania… Choroby rýb: Príručka
I Medicine Medicína je systém vedeckých poznatkov a praxe zameraný na upevňovanie a udržanie zdravia, predlžovanie ľudského života, prevenciu a liečbu ľudských chorôb. Na splnenie týchto úloh M. študuje štruktúru a ... ... Lekárska encyklopédia
Spôsoby, ako študovať rôzne objekty pomocou mikroskopu. V biológii a medicíne tieto metódy umožňujú študovať štruktúru mikroskopických objektov, ktorých rozmery presahujú rozlišovaciu schopnosť ľudského oka. Základom M.m.i. tvorí…… Lekárska encyklopédia
- (histologická bunka cytus + grécka doktrína logos) je založená na štúdiu pomocou mikroskopu štrukturálnych znakov buniek, bunkového zloženia orgánov tkaniva, telesných tekutín ľudí a zvierat v normálnych a patologických procesoch. C. a ......... Lekárska encyklopédia
I Histológia (grécky histos tkanivo + učenie logos) je biomedicínska veda, ktorá študuje evolúciu tkanív, ich vývoj v tele (histogenézu), štruktúru, funkcie a interakcie u mnohobunkových živočíchov a ľudí. Hlavným predmetom štúdia G. ...... Lekárska encyklopédia
I Vulva (vulva; pudendum femininum) vonkajšie ženské pohlavné orgány (podľa Medzinárodnej anatomickej nomenklatúry oblasť ženských pohlavných orgánov). Anatómia a fyziológia. Vulva (obr. 1) sa nachádza mimo lonových kostí panvy a je k nim pripevnená ... ... Lekárska encyklopédia
Štúdiom zmien spôsobených v organizme rôznymi chorobnými procesmi sa snaží svojimi vlastnými výskumnými metódami určiť tieto chorobné procesy a ich význam vo vzťahu ku klinickému obrazu choroby a smrti ... ... Encyklopedický slovník F.A. Brockhaus a I.A. Efron
I Biopsia (grécky bios life + opsis videnie, zrakové vnímanie) intravitálny odber tkanív, orgánov alebo bunkových suspenzií na mikroskopické vyšetrenie na diagnostické účely, ako aj na štúdium dynamiky patologického procesu a vplyvu ... ... Lekárska encyklopédia
Veda, ktorá študuje tkanivá zvierat. Tkanivo je skupina buniek, ktoré sú podobné tvarom, veľkosťou a funkciou a svojimi metabolickými produktmi. Vo všetkých rastlinách a zvieratách, s výnimkou tých najprimitívnejších, sa telo skladá z tkanív, ... ... Collierova encyklopédia
- (z gr. ἱστός tkanivo a gr. λόγος poznanie, slovo, veda) odvetvie biológie, ktoré študuje stavbu tkanív živých organizmov. Zvyčajne sa to robí rozrezaním tkaniva na tenké vrstvy a použitím mikrotómu. Na rozdiel od anatómie, ... ... Wikipedia
knihy
- Mnohopočetný myelóm a plazmatické bunkové choroby, Ramasami Kartik, Lonial Sagar. Kniha predstavuje hlavné klinické aspekty mnohopočetného myelómu a iných ochorení plazmatických buniek. Sú opísané laboratórne štúdie, patogenéza, diagnostika a liečba. V druhom…
Predmetom štúdia môžu byť pevné (mŕtve) alebo živé bunky a tkanivá.
Na štúdium mikroštruktúry surovín a produktov živočíšnej výroby sa spravidla používajú fixované bunky a tkanivá. Prípravky sú dočasné, určené na jedno štúdium a trvalé, ktoré je možné skladovať a opakovane skúmať. Okrem toho sa používajú celkové alebo celé prípravky.
Dočasné drogy môže byť varené pomerne rýchlo; na tento účel je študovaný materiál fixovaný a rezy sú získavané na mraziacom mikrotóme, v jeho neprítomnosti je možné urobiť tenký rez tkaniva alebo orgánu skalpelom alebo čepeľou. Výsledná časť sa zafarbí, umiestni sa na podložné sklíčko a potom sa nanesie kvapka glycerínu a prekryje sa krycím sklíčkom. Na detekciu škrobu sa používa roztok jódu v jodide draselnom: 0,5 g jodidu draselného sa rozpustí v malom množstve vody, pridá sa 1 g kryštalického jódu a do 100 cm3 sa pridá voda. Niekoľko kvapiek činidla sa aplikuje na tenký kúsok klobásy, syra a iného materiálu umiestneného na podložnom sklíčku, škrob sa zmení na modrofialový.
Celkové alebo celé prípravky vyšetrené bez získania rezu tkaniva alebo orgánu. Napríklad film podkožného tkaniva alebo rozdrvený prípravok z koreňa rastliny po fixácii, umytí a zafarbení sa vloží medzi sklíčko a krycie sklíčko. Na identifikáciu jednotlivých štruktúrnych prvkov sa fixované a zafarbené kúsky podkožia alebo tkaniva hladkého svalstva vytrhávajú ihlou na podložnom sklíčku – takéto prípravky sa nazývajú trhané. V niektorých prípadoch, napríklad pri skúmaní filmu sietnice očnej buľvy alebo kože pulca, sa po fixácii a umytí farbenie nevykonáva, pretože bunky obsahujú organické inklúzie (pigment), ktoré majú prirodzenú farbu.
Spôsob prípravy histologického preparátu. Hlavná metóda na štúdium fixovaných buniek a tkanív je histologická, t.j. štúdium zafarbeného rezu tkaniva uzavretého v špeciálnom médiu. Na získanie rezov sa používa naliatie testovaného materiálu do parafínu alebo celoidínu, čo umožňuje získať tenké rezy (5-7 mikrónov, resp. 10-30 mikrónov), na rýchlu prípravu rezov (40-60 mikrónov), zmrazenie používa sa technika.
Hlavné fázy prípravy histologickej vzorky sú: odber vzoriek, fixácia, umývanie, dehydratácia, zaliatie do parafínu alebo celoidínu, farbenie, umiestnenie pod krycie sklíčko.
Výber vzorky sa robí s prihliadnutím na účel štúdie a štruktúru materiálu. Veľkosť vzorky by v priemere nemala presiahnuť 2,5-3,0 cm Vzorky pečene a sleziny sa odoberajú kapsulou. Zo srdca sú vyrezané kúsky predsiene, pretože membrány sú tenšie ako v komorách a na jednom preparáte je vidieť topografický vzťah epikardu, myokardu a endokardu. Z obličiek, lymfatických uzlín, nadobličiek sa vyrežú úseky orgánov, ktoré idú hlboko do povrchu kolmo na povrch tak, aby sa na preparáte odhalila kôra a dreň. Ak je potrebné pripraviť preparáty zmenených orgánov, vyrežú sa kúsky testovaného materiálu na hranici postihnutej oblasti tak, aby bola vo vzorke zahrnutá aj prechodová zóna lézie. Vzorky z kostrových svalov by sa mali odrezať tak, aby svalové vlákna boli v pozdĺžnych a priečnych rezoch. Vzorky vzoriek mletého mäsa, tvarohu a iných rozpadajúcich sa vzoriek najskôr vložíme do kúska gázy a previažeme niťou. Malo by sa pamätať na to, že pri otvorení hrudnej dutiny sa pľúca zrútia v dôsledku elasticity a výrazne strácajú vzdušnosť, preto sa do priedušnice extrahovaných dýchacích orgánov vloží sklenená alebo gumová trubica, cez ktorú sa mierne vstrekuje vzduch. . Na priedušnicu pod vloženou trubicou sa aplikuje hodvábna ligatúra a na úplné ponorenie sa priviaže záťaž. Na fixáciu čriev je časť orgánu určená na fixáciu predbežne obviazaná ligatúrami na oboch stranách. Vzorky sú vybavené hrubými papierovými štítkami s uvedením počtu a dátumu odberu vzoriek.
fixácia, tie. zachovanie prirodzenej (celoživotnej) architektoniky sa uskutočňuje s cieľom preniesť živú protoplazmu štruktúr do nemenného stavu. Pôsobenie fixatív sa prejavuje v tom, že v dôsledku biofyzikálnych procesov dochádza v tkanivách a orgánoch k ireverzibilnej koagulácii bielkovín. Vzorka tkaniva odobratá z orgánu sa čo najskôr ponorí do fixačného prostriedku; pomer objemu materiálu a fixačnej kvapaliny musí byť minimálne 1:9 (obr. 3).
Fixácia vedie k určitému zhutneniu a zníženiu objemu vzorky. Najčastejšie sa na fixáciu používa 10-12% formalín, etylalkohol, acetón. Na prípravu uvedenej koncentrácie fixačnej tekutiny sa 40% formalín zriedi vodou z vodovodu. Etylalkohol (100% absolútny alebo 96%) sa používa v prípadoch, keď je potrebné identifikovať látky, ktoré sa rozpúšťajú vo vodných fixatívoch (napríklad glykogén) v rezoch. V acetóne sa skúmaný materiál (napríklad mozog) fixuje len niekoľko hodín. Keď skúmaný orgán, ako napríklad kostné tkanivo, obsahuje vápno, vykoná sa odvápnenie alebo kalcifikácia. Za týmto účelom sa malý kúsok kosti spustí (je lepšie ho zavesiť na niť) v 5-8% vodnom roztoku kyseliny dusičnej, ktorý sa mení 2-3 krát denne. Výsledok odvápnenia posúdime zapichnutím tenkej ihly do kosti: ak nekladie odpor, odvápňovanie je ukončené. Po takomto pro-
splachovanie sa vykonáva na odstránenie prebytočného množstva fixačného prostriedku, napríklad po fixácii formalínom sa premýva tečúcou vodou z vodovodu.
Dehydratácia uskutočnené na zhutnenie materiálu v etylalkohole so zvyšujúcou sa koncentráciou: 50-70-100. Na prípravu 50% a 70% alkoholu sa 96% alkohol zriedi destilovanou vodou. Na prípravu 100% alkoholu je potrebné zahriať síran meďnatý až do úplnej dehydratácie a pridať 96% etylalkohol k dehydratovanému bielemu prášku. V každej koncentrácii alkoholu sa materiál uchováva 1-24 hodín, v závislosti od veľkosti kusov, štruktúry orgánu; v 70% alkohole je možné materiál skladovať niekoľko dní.
vyplniť sa uskutočňuje v takom médiu, aby sa skúšobná vzorka stala pevnou, čo umožňuje získať tenké rezy. K tomu použite parafín (impregnácia na 1-4 hodiny), celoidín (impregnácia na tri týždne). Pri odhaľovaní tukov a na štúdium voľných tkanív a orgánov sa používa nalievanie do želatíny.
plátky prijímajú na sánku alebo rotačné mikrotómy. Najtenšie časti (5-7 mikrónov) môžu byť vyrobené z materiálu zaliateho v parafíne. Z materiálu naplneného celoidínom sa pripravia rezy s hrúbkou 15 až 20 mikrónov. Na štúdium mikroštruktúry surovín a produktov živočíšneho pôvodu sa spravidla používa technika mrazenia. To urýchľuje prípravu prípravku, pretože odpadá dlhé fázy dehydratácie a nalievania. Po fixácii a umytí sa kúsky predmetu umiestnia na mokrý stolík mraziaceho mikrotómu a získajú sa rezy s hrúbkou 40-60 μm. Rezy sa prenesú štetcom do vody, kde sa narovnajú a získajú vzhľad najtenších sivastých úlomkov.
Farbenie sekcií uskutočňované na zvýšenie kontrastu rôznych štruktúr v prípravkoch určených na skúmanie vo svetelnom mikroskope. V procese farbenia sa vyskytujú zložité chemické a fyzikálne procesy, preto sa pri výbere metódy berie do úvahy selektívna afinita bunkových štruktúr k určitým farbivám s rôznymi fyzikálno-chemickými vlastnosťami.
Existujú farbivá zásadité (bazálne), kyslé a špeciálne. Štruktúry farbené základnými farbivami sú tzv bazofilný, kyslé farbivá - oxyfilné, acidofilné, eozinofilné.
Zo základných (bazálnych) farbív sa používa hematoxylín, ktorý farbí chromatín jadra a ďalšie štruktúry obsahujúce bielkovinu na modro alebo fialovo; karmín, sfarbenie jadra do svetločervenej farby, safranín - tmavočervená farba, tionín - modrá farba.
Z kyslých farbív sa používa eozín (farbí cytoplazmu do ružova), kyselina pikrová (žltá), fuchsín (tehlová farba), indigokarmín (modrá).
Pri štúdiu mikroštruktúry surovín a produktov živočíšnej výroby sa najčastejšie používa kombinované farbenie hematoxylínom a eozínom. Na tento účel sa časti z vody prenesú na 1-3 minúty do roztoku hematoxylínu; Premyté vo vode počas 20-30 minút, vložené do roztoku eozínu na 3-5 minút a premývané vodou počas 3-5 minút. Zvyšná voda sa odstráni filtračným papierom, na 1 až 2 minúty sa aplikuje kvapka 96 % etanolu a dehydratuje sa v 25 % roztoku kyseliny karbolovej v xyléne alebo toluéne. Potom sa na rez aplikujú 1-2 kvapky balzamu a prikryjú sa krycím sklíčkom.
Z farbív, ktoré farbia tukové inklúzie, sa často používa Sudan 111. Na prípravu roztoku farbiva v 95 cm 3 85 % etylalkoholu sa pridá 5 cm 3 acetónu a leje sa prášok Sudan III, kým sa nezíska nasýtený roztok (napr. farbivo musí byť obsiahnuté v nadbytku). Zmes sa zahreje na 50 % C a prefiltruje. Rezy získané na mraziacom mikrotóme sa umiestnia na 1-2 minúty do 50 % etanolu a potom na 25 minút do Sudánu III. Rezy sa opláchnu v 50% alkohole, premyjú destilovanou vodou a zalejú do glycerol-želatíny.
Kvapky neutrálneho tuku sa sfarbujú do oranžova v dôsledku rozpustenia Sudánu III v tukoch. Tukové inklúzie môžu byť tiež detekované pomocou kyseliny osmiovej, zatiaľ čo tukové štruktúry sú sfarbené na čierno.
Záver pod krycím sklíčkom vykonávané v prostrediach, ktoré neprepúšťajú vzduch a sú schopné udržať rez po dlhú dobu. Zafarbené rezy sa dehydratujú v alkoholoch so zvyšujúcou sa silou a umiestnia sa pod krycie sklíčko do jedle, kanadského balzamu alebo glycerol-želatíny (prípravok by nemal prísť do styku s alkoholmi a xylénom).
Príprava vzoriek pre elektrónovú mikroskopiu. Na štúdium biologických objektov sa používajú dva typy elektrónových mikroskopov: transmisný (transmisný) a skenovací (rastrový).
Princíp spracovania predmetu na vyšetrenie v transmisnom elektrónovom mikroskope je založený na rovnakých princípoch ako pri optických mikroskopoch: odber vzoriek, fixácia, umývanie, dehydratácia, liatie, príprava ultratenkých rezov, kontrastovanie.
Výber vzorky sa vykonáva s prihliadnutím na účel štúdie a štruktúru materiálu pri dodržaní rovnakých pravidiel ako pri svetelnej mikroskopii. Objem kusov študovaného materiálu by nemal presiahnuť 1 mm 3 . Hlavným účelom fixácie je udržať tkanivo čo najbližšie k životu.
Fixácia Vykonáva sa kvôli lepšiemu zachovaniu štruktúr, preto je potrebné použiť činidlá s určitým pH a izotonicitou, ktorých hodnoty sú určené typom fixovaného tkaniva. Proces fixácie sa uskutočňuje v dvoch fázach: prefixácia a postfixácia. Na prefixáciu sa používa roztok 2,5-3% roztoku glutaraldehydu (pH 7,2-7,4), doba fixácie je 2-4 hodiny Postfixácia sa vykonáva v 2% roztoku (pH 7,2-7,4) - 1- 2 hodiny Pre zachovanie intravitálnej štruktúry sa odporúča použiť nízkoteplotný fixátor (0-4 °C) a pripraviť fixatíva na roztokoch fosfát-pufr, kakodylát, veronal-acetát.
splachovanie prevádza sa 30% studeným liehom 5-7x, predmet sa v každej porcii liehu drží 30 minút, t.j. vymyté z fixačného prostriedku do takého stavu, keď oxidačné pôsobenie fixačného prostriedku ustane.
Dehydratácia vykonávať s etylalkoholmi so zvyšujúcou sa silou: 30, 50, 70, 96, 100 % počas 30 minút. Pri niektorých metódach nalievania sa na odvodnenie odporúča pridanie acetónu a propylénoxidu.
vyplniť realizované v epoxidových živiciach (araldit, epon atď.). Polymerizácia živíc v kapsulách sa uskutočňuje v termostate pri 60 °C až do vytvrdnutia spravidla v priebehu 1-2 dní.
Ultratenké časti sa získavajú pomocou sklenených nožov na ultramikrotóme; na tento účel sú epoxidové bloky naostrené vo forme štvorstennej zrezanej pyramídy. Sériové sivasté rezy sa umiestnia do kúpeľa s 10 % etanolom. Výsledné rezy sú namontované na medených alebo paládiových pletivách, na ktorých povrchu je predbežne nanesená formvarová fólia. Na odhalenie potrebných štruktúr sa časti sietiek ošetria roztokmi citrátu olovnatého a octanu uranylu.
Pre rastrovacia elektrónová mikroskopia testovaná vzorka je fixovaná, dehydratovaná, v závislosti od účelu štúdie, pomocou vyššie uvedených fixatív. Po dehydratácii sa vzorka nalepí na držiak, umiestni sa do naprašovacej jednotky a potiahne sa veľmi tenkou vrstvou zlata alebo platiny. Na rozdiel od transmisnej elektrónovej mikroskopie môže skenovacia elektrónová mikroskopia používať korozívne prípravky: predmet štúdie sa naleje s niektorými vytvrdzujúcimi látkami a potom sa skúmajú odliatky a povrchy. Skúmajú aj repliky získané zmrazením – čipovaním. V tomto prípade sa skúma odtlačok štiepenia povrchu predmetu. Pre zvýšenie kontrastu je potrebné repliky zatieniť nástrekom kovových častíc (zlato, platina) alebo uhlia.
testovacie otázky
- 1. Aké metódy sa používajú pri štúdiu bunkových štruktúr, tkanív a orgánov?
- 2. Aké základné pravidlá treba dodržiavať pri odbere vzoriek na prípravu histologických preparátov?
- 3. Aké sú vlastnosti prípravy prípravkov z kostného tkaniva?
- 4. Ako sa fixuje testovací materiál?
- 5. Čo sa používa na dehydratáciu prípravkov?
- 6. Aké médiá sa používajú na nalievanie testovaného materiálu?
- 7. Aké farbivo sa používa na zistenie tukového tkaniva?
- 8. Aká je najbežnejšie používaná metóda delenia a prečo?
- 9. Vymenujte hlavné etapy prípravy preparátov pre transmisnú a rastrovaciu elektrónovú mikroskopiu.
Histológia - ("gistos" v gréčtine - tkanivo, logis - učenie) Je to veda o štruktúre, vývoji a životnej činnosti tkanív mnohobunkových organizmov a ľudí. Predmety, ktoré sú predmetom tejto vedy, sú voľným okom nedostupné. Preto je história histológie úzko spätá s históriou vytvárania takých prístrojov, ktoré nám umožňujú študovať tie najmenšie predmety voľným okom. 2
Priebeh histológie je konvenčne rozdelený do nasledujúcich častí: n 1. Cytológia je veda o bunke. n 2. Embryológia je veda o vývoji, od počiatku až po úplné sformovanie organizmu. n 3. Všeobecná histológia - veda o všeobecných vzorcoch vlastných tkanív. n 4. Privátna histológia – študuje stavbu, vývoj orgánov a systémov.
CYTOLÓGIA - (grécky κύτος "bunka" a λόγος - "štúdium", "veda") n Odvetvie biológie, ktoré študuje živé bunky, ich organely, ich štruktúru, fungovanie, procesy bunkovej reprodukcie, starnutia a smrti. štyri
EMBRYOLÓGIA n (z iného -gr. ἔμβρυον - embryo, embryo + -λογία z λόγος - učenie) je veda, ktorá študuje vývoj embrya. 5
História vzniku bunkovej teórie 1590. Jansen vynašiel mikroskop, v ktorom bolo zväčšenie zabezpečené spojením dvoch šošoviek. 1665. Robert Hooke prvýkrát použil výraz bunka. 1650-1700 rokov. Anthony van Leeuwenhoek prvýkrát opísal baktérie a iné mikroorganizmy. 1700 - 1800 rokov. Bolo publikovaných mnoho nových popisov a nákresov rôznych tkanív, najmä rastlinných. V roku 1827 Karl Baer objavil vajce u cicavcov. 1831 - 1833 rokov. Robert Brown opísal jadro v rastlinných bunkách. 1838 - 1839 rokov. Botanik Matthias Schleiden a zoológ Theodor Schwann spojili myšlienky rôznych vedcov a sformulovali bunkovú teóriu, ktorá predpokladala, že základnou jednotkou štruktúry a funkcie v živých organizmoch je bunka. 1855 Rudolf Virchow ukázal, že všetky bunky vznikajú ako výsledok bunkového delenia.
História vzniku bunkovej teórie 1665. Anglický vedec, fyzik Robert Hooke, skúmajúc časť korku pod mikroskopom zistil, že pozostáva z buniek oddelených priečkami. Tieto bunky nazval "bunky"
História vzniku bunkovej teórie V 17. storočí skonštruoval Leeuwenhoek mikroskop a otvoril ľuďom dvere do mikrokozmu. Pred očami užasnutých výskumníkov sa mihali rôzne nálevníky, vírniky a iné drobné živé tvory. Ukázalo sa, že sú všade - tieto najmenšie organizmy: vo vode, v hnoji, vo vzduchu a prachu, v zemi a odkvapoch, v hnijúcom odpade živočíšneho a rastlinného pôvodu.
História vzniku bunkovej teórie 1831-1833. Robert Brown opísal jadro v rastlinných bunkách. V roku 1838 na jadro upozornil nemecký botanik M. Schleiden a považoval ho za pôvodcu bunky. Podľa Schleidena sa jadro kondenzuje z granulovanej látky, okolo ktorej sa tvorí jadro, a okolo jadra - bunka, pričom jadro môže v procese tvorby bunky zaniknúť.
História vzniku bunkovej teórie Nemecký zoológ T. Schwann ukázal, že aj živočíšne tkanivá pozostávajú z buniek. Vytvoril teóriu, podľa ktorej bunky obsahujúce jadrá predstavujú štrukturálny a funkčný základ všetkého živého. Bunkovú teóriu štruktúry sformuloval a publikoval T. Schwann v roku 1839. Jej podstatu možno vyjadriť v nasledujúcich ustanoveniach: 1. Bunka je základnou štruktúrnou jednotkou štruktúry všetkých živých bytostí; 2. Bunky rastlín a živočíchov sú nezávislé, navzájom homológne v pôvode a štruktúre. Každá bunka funguje nezávisle od ostatných, ale spoločne so všetkými. 3. Všetky bunky vznikajú z bezštruktúrnej medzibunkovej látky. (Omyl!) 4. Životnú aktivitu bunky určuje obal. (Chyba!)
História vzniku bunkovej teórie V roku 1855 nemecký lekár R. Virchow zovšeobecnil: bunka môže vzniknúť len z predchádzajúcej bunky. To viedlo k uvedomeniu si skutočnosti, že rast a vývoj organizmov je spojený s delením buniek a ich ďalšou diferenciáciou, čo vedie k tvorbe tkanív a orgánov.
História vytvorenia bunkovej teórie Karlom Baerom V roku 1827 Karl Baer objavil vajíčko u cicavcov a dokázal, že vývoj cicavcov začína oplodneným vajíčkom. To znamená, že vývoj akéhokoľvek organizmu začína jedným oplodneným vajíčkom, bunka je jednotkou vývoja.
História vzniku bunkovej teórie 1865 Boli publikované zákony dedičnosti (G. Mendel). 1868 boli objavené nukleové kyseliny (F. Miescher) 1873 objavené chromozómy (F. Schneider) 1874 objavená mitóza v rastlinných bunkách (I. D. Chistyakov) 1878 objavené mitotické delenie živočíšnych buniek (W. Fleming, P. I. Peremezhko) 1879 Fleming – správanie sa chromozómov pri delení. 1882 V živočíšnych bunkách bola objavená meióza (W. Fleming) 1883 Ukázalo sa, že počet chromozómov v zárodočných bunkách je dvakrát menší ako v somatických bunkách (E. Van Beneden) 1887 V rastlinných bunkách bola objavená meióza (E. Strasburger) 1898 Golgi objavil sieťový aparát bunky, Golgiho aparát. 1914 Bola sformulovaná chromozómová teória dedičnosti (T. Morgan). 1924 Vyšla prírodovedná teória o vzniku života na Zemi (A. I. Oparin). 1953 Boli sformulované predstavy o štruktúre DNA a bol vytvorený jej model (D. Watson a F. Crick). 1961 Stanovuje sa povaha a vlastnosti genetického kódu (F. Crick, L. Barnet, S. Benner).
Hlavné ustanovenia modernej bunkovej teórie 1. Bunka je elementárny živý systém, jednotka štruktúry, životnej činnosti, rozmnožovania a individuálneho vývoja organizmov. 2. Bunky všetkých živých organizmov sú homológne, jednotné v štruktúre a pôvode. 3. Tvorba buniek. Nové bunky vznikajú len delením už existujúcich buniek. 4. Bunka a organizmus. Bunka môže byť nezávislý organizmus (prokaryoty a jednobunkové eukaryoty). Všetky mnohobunkové organizmy sa skladajú z buniek. 5. Funkcie buniek. V bunkách prebieha metabolizmus, dráždivosť a excitabilita, pohyb, reprodukcia a diferenciácia. 6. Bunková evolúcia. Bunková organizácia vznikla na úsvite života a prešla dlhou cestou evolučného vývoja od bezjadrových foriem (prokaryoty) po jadrové formy (eukaryoty).
METÓDY MIKROSKOPIE HISTOLOGICKÝCH VZORIEK 1. Svetelná mikroskopia. 2. Ultrafialová mikroskopia. 3. Fluorescenčná (luminiscenčná) mikroskopia. 4. Fázová kontrastná mikroskopia. 5. Mikroskopia v tmavom poli. 6. Interferenčná mikroskopia 7. Polarizačná mikroskopia. 8. Elektrónová mikroskopia. 17
Mikroskop n Tento optický prístroj umožňuje pozorovanie malých predmetov. Zväčšenie obrazu je dosiahnuté sústavou objektívových šošoviek a okuláru. Zrkadlo, kondenzor a clona usmerňujú svetelný tok a regulujú osvetlenie objektu. Mechanická časť mikroskopu obsahuje: statív, stolík na predmety, makro- a mikrometrické skrutky, držiak tubusu. osemnásť
Špeciálne metódy mikroskopie: - mikroskop s fázovým kontrastom - (na štúdium živých nefarbených predmetov) - mikroskopia umožňuje študovať živé a nefarbené predmety. Pri prechode svetla cez farebné predmety sa mení amplitúda svetelnej vlny a pri prechode svetla cez nefarebné predmety sa mení fáza svetelnej vlny, čo sa využíva na získanie vysoko kontrastného obrazu vo fázovo kontrastnej a interferenčnej mikroskopii. - mikroskop v tmavom poli (na štúdium živých nepoškvrnených predmetov). Použitý je špeciálny kondenzor, ktorý zvýrazňuje kontrastné štruktúry nelakovaného materiálu. Mikroskopia v tmavom poli umožňuje pozorovať živé objekty. Pozorovaný objekt sa javí ako osvetlený v tmavom poli. V tomto prípade lúče z iluminátora dopadajú na objekt zboku a do šošoviek mikroskopu vstupujú len rozptýlené lúče. 19
Špeciálne metódy mikroskopie Luminiscenčný mic-p (na štúdium živých nefarbených predmetov) Mikroskopia sa používa na pozorovanie fluorescenčných (luminiscenčných) objektov. Vo fluorescenčnom mikroskope svetlo z výkonného zdroja prechádza cez dva filtre. Jeden filter blokuje svetlo pred vzorkou a umožňuje svetlu s vlnovou dĺžkou, ktorá excituje vzorku, aby fluoreskovala. Druhý filter umožňuje prechod svetla s vlnovou dĺžkou vyžarovaného fluorescenčným objektom. Fluorescenčné objekty teda absorbujú svetlo jednej vlnovej dĺžky a vyžarujú svetlo v inej oblasti spektra. -ultrafialová schopnosť m-pa) mic-p (zvyšuje rozlíšenie -polarizácia mic-p (pre výskumné objekty s usporiadaným usporiadaním molekúl - kostra, sval, kolagénové vlákna a pod.) mikroskopia - tvorba obrazu nezafarbených anizotropných štruktúr ( napr. ako kolagénové vlákna a myofibrily).20
Špeciálne metódy mikroskopie - interferenčná mikroskopia (na určenie suchého zvyšku v bunkách, určenie hrúbky predmetov) - mikroskopia spája princípy fázovo-kontrastnej a polarizačnej mikroskopie a používa sa na získanie kontrastného obrazu nezafarbených predmetov. Špeciálna interferenčná optika (Nomarsky optics) našla uplatnenie v mikroskopoch s diferenciálnym interferenčným kontrastom. C. Elektrónová mikroskopia: -transmisná (štúdium predmetov prostredníctvom prenosu) -skenovanie (štúdium povrchu predmetov) Teoreticky je rozlíšenie prenosového EM 0,002 nm. Reálne rozlíšenie moderných mikroskopov sa blíži k 0,1 nm. Pre biologické objekty je EM rozlíšenie v praxi 2 nm. 21
Špeciálne mikroskopické techniky Transmisný elektrónový mikroskop pozostáva zo stĺpca, cez ktorý vo vákuu prechádzajú elektróny emitované katódovým vláknom. Cez pripravenú vzorku prechádza elektrónový lúč zaostrený prstencovými magnetmi. Charakter rozptylu elektrónov závisí od hustoty vzorky. Elektróny prechádzajúce vzorkou sú zaostrené, pozorované na fluorescenčnej obrazovke a zaznamenané pomocou fotografickej platne. Na získanie trojrozmerného obrazu povrchu skúmaného objektu sa používa rastrovací elektrónový mikroskop. Metóda čipovania (zmrazovanie-štiepenie) sa používa na štúdium vnútornej štruktúry bunkových membrán. Bunky sa zmrazia pri teplote kvapalného dusíka v prítomnosti kryoprotektantu a použijú sa na výrobu čipov. Roviny štiepenia prechádzajú cez hydrofóbny stred lipidovej dvojvrstvy. Odkrytý vnútorný povrch membrán je zatienený platinou, výsledné repliky sa študujú na skenovacom EM. 22
Špeciálne (nemikroskopické) metódy: 1. Cyto- alebo histochémia - podstatou je využitie prísne špecifických chemických reakcií s ľahkým konečným produktom v bunkách a tkanivách na stanovenie množstva rôznych látok (bielkoviny, enzýmy, tuky, sacharidy, atď.). Možno aplikovať na úrovni svetelného alebo elektrónového mikroskopu. 2. Cytofotometria - metóda sa používa v kombinácii s 1 a umožňuje kvantifikovať cytohistochemickou metódou identifikované proteíny, enzýmy atď.. 3. Autorádiografia - do organizmu sa vpravujú látky obsahujúce rádioaktívne izotopy chemických prvkov. Tieto látky sú súčasťou metabolických procesov v bunkách. Lokalizácia, ďalší pohyb týchto látok v orgánoch sa zisťuje na histologických preparátoch žiarením, ktoré je zachytené fotografickou emulziou nanesenou na preparát. 4. Röntgenová difrakčná analýza - umožňuje určiť množstvo chemických prvkov v bunkách, študovať molekulárnu štruktúru biologických mikroobjektov. 24 5. Morfometria - meranie veľkosti biol. štruktúry na bunkovej a subcelulárnej úrovni.
Špeciálne (nemikroskopické) metódy 6. Mikrourgia - vykonávanie veľmi jemných operácií s mikromanipulátorom pod mikroskopom (transplantácia jadra, zavádzanie rôznych látok do buniek, meranie biopotenciálov a pod.) 6. Metóda kultivácie buniek a tkanív - v r. živných médiách alebo v difúznych komorách, implantovaných do rôznych telesných tkanív. 7. Ultracentrifugácia - frakcionácia buniek alebo subcelulárnych štruktúr centrifugáciou v roztokoch rôznych hustôt. 8. Experimentálna metóda. 9. Spôsob transplantácie tkanív a orgánov. 25
Fixácia zachováva štruktúru buniek, tkanív a orgánov, zabraňuje ich bakteriálnej kontaminácii a enzymatickému tráveniu a stabilizuje makromolekuly ich chemickým zosieťovaním. 32
Fixačný tekutý formalín, alkoholy, glutaraldehyd - Najbežnejšie fixačné prostriedky; Kryofixácia - Najlepšie uchovanie štruktúr je zabezpečené okamžitým zmrazením vzoriek v tekutom dusíku (-196°C); Lyofilizácia - malé kúsky tkaniva sú podrobené rýchlemu zmrazeniu, čo zastavuje metabolické procesy. Dehydratácia – štandardným postupom na odstraňovanie vody je dehydratácia v alkoholoch so zvyšujúcou sa silou (od 70 do 60 %). Výplň - robí tkaninu odolnou, zabraňuje jej drveniu a krčeniu pri strihaní, umožňuje získať strihy štandardnej hrúbky. Najbežnejším zalievacím médiom je parafín. Používa sa aj celoidín, plastové médiá a živice. 33
Dehydratácia pripravuje fixované tkanivo na penetráciu zalievacieho média. Voda zo živého tkaniva, ako aj voda z fixačných zmesí (väčšina fixatív sú vodné roztoky) sa musia po fixácii úplne odstrániť. Štandardným postupom na odstraňovanie vody je dehydratácia v alkoholoch s koncentráciou od 60° do 100°. 34
Plnenie je nevyhnutný postup, ktorý predchádza príprave rezov. Výplň robí tkaninu odolnou, zabraňuje jej rozdrveniu a pokrčeniu počas rezania a umožňuje získať tenké časti štandardnej hrúbky. Najbežnejším zalievacím médiom je parafín. Používa sa aj celoidín, plastové médiá a živice. 35
Rotačný mikrotóm. 40 n Bloky obsahujúce kus orgánu sú upevnené v pohyblivom držiaku objektu. Keď sa spustí, na noži zostanú sériové rezy, ktoré sa z noža odstránia a namontujú na podložné sklíčko na ďalšie spracovanie a mikroskopiu.
Metódy histosekčného farbenia: n Jadrové (základné): n hematoxylín - farbí n n n n jadrá modrou; hematoxylín železa; azur II (vo fialovej); karmín (v červenej farbe); safranín (v červenej farbe); metylová modrá (na modrú); toluidín (v modrej farbe); tionín (v modrej farbe). n Cytoplazmatická- (kyselina): n eozín - v ružovej farbe; n erytrozín; n oranžové "G" ; n kyslý fuchsín - do červena; n kyselina pikrová - žltá; n Kongo - červená - až červená 44
ŠPECIÁLNE Metódy farbenia histosekcií n Sudan III – oranžové farbenie lipidov a tukov; n kyselina osminová - sfarbenie lipidov a tukov na čierno; n orcein - hnedé sfarbenie elastických vlákien; n dusičnan strieborný - impregnácia nervových prvkov v tmavohnedej farbe. 45
Bunkové štruktúry: n OXYFILIAN schopnosť farbiť sa do ružova kyslými farbivami n Basophilian schopnosť farbiť sa do modra zásaditými farbivami n Neutrofília - n schopnosť farbiť do fialova kyslými a zásaditými farbivami. 47
1
Bunka n je elementárny živý systém pozostávajúci z cytoplazmy, jadra, membrány a je základom pre vývoj, stavbu a život živočíšnych a rastlinných organizmov.
Glykokalyx je epimembránový komplex zložený zo sacharidov viazaných na proteíny a sacharidov viazaných na lipidy. Funkcie n Recepcia (hormóny, cytokíny, mediátory a antigény) n Medzibunkové interakcie (dráždivosť a rozpoznávanie) n Parietálne trávenie (mikroklky hraničných buniek čreva)
Funkcie cytolemy: - ohraničujúce; - aktívny a pasívny transport látok v oboch smeroch; - funkcie receptorov; kontakt so susednými bunkami.
Hlavné Výskumné objekty sú histologické preparáty a hlavnou výskumnou metódou je mikroskopia.
Histologický preparát by mal byť dostatočne transparentný (tenký) a kontrastný. Je vyrobený zo živých aj mŕtvych (pevných) štruktúr. Prípravkom môže byť suspenzia buniek, náter, odtlačok, film, celkový prípravok a tenký rez.
Proces výroby histologických preparátov na mikroskopické štúdie zahŕňa nasledujúce hlavné kroky: 1) odoberanie materiálu a jeho fixovanie; 2) zhutňovanie materiálu; 3) príprava sekcií; 4) farbenie alebo kontrastné časti; 5) záver sekcií.
Na farbenie sa používajú špeciálne histologické farbivá s rôznymi hodnotami pH: kyslé, neutrálne a zásadité. Štruktúry nimi zafarbené sa nazývajú oxyfilné, neutrofilné (heterofilné) a bazofilné.
Aké metódy používa histologická veda? Sú pomerne početné a rôznorodé:
Mikroskopia.
Svetelná mikroskopia. Moderné mikroskopy majú vysoké rozlíšenie. Rozlíšenie je definované ako najmenšia vzdialenosť (d) medzi dvoma susednými bodmi, ktoré možno vidieť oddelene. Táto vzdialenosť závisí od vlnovej dĺžky svetla (λ) a je vyjadrená vzorcom: d = 1/2 λ.
Minimálna vlnová dĺžka viditeľnej časti spektra je 0,4 µm. Preto je rozlišovacia schopnosť svetelného mikroskopu 0,2 µm a celkové zväčšenie dosahuje 2500-krát.
ultrafialová mikroskopia . Vlnová dĺžka ultrafialového svetla je 0,2 µm, preto je rozlíšenie ultrafialového mikroskopu 0,1 µm, ale keďže ultrafialové žiarenie je neviditeľné, na pozorovanie skúmaného objektu je potrebná luminiscenčná clona.
Fluorescenčná (luminiscenčná) mikroskopia. Krátkovlnné (neviditeľné) žiarenie, ktoré je absorbované množstvom látok, excituje ich elektróny, ktoré vyžarujú svetlo s väčšou vlnovou dĺžkou a stávajú sa viditeľnou časťou spektra. Tým sa dosiahne zvýšenie rozlíšenia mikroskopu.
Fázová kontrastná mikroskopia umožňuje vyžarovať nezafarbené predmety.
Polarizačná mikroskopia používa sa na štúdium architektoniky histologických štruktúr, ako sú kolagénové vlákna.
elektrónová mikroskopia umožňuje študovať objekty zväčšené desaťtisíckrát.
Mikrofotografia a mikrofilmografia . Tieto metódy umožňujú študovať pevné objekty na fotografiách a živé mikroskopické objekty v pohybe.
Metódy kvalitatívneho a kvantitatívneho výskumu.
Histo –a cytochémie , vrátane kvantitatívneho, umožňuje kvalitatívnu analýzu študovaných objektov na tkanivovej, bunkovej a subcelulárnej úrovni.
Cytospektrofotometria Umožňuje študovať kvantitatívny obsah určitých biologických látok v bunkách a tkanivách na základe absorpcie svetla určitej vlnovej dĺžky farbivom s nimi spojeným.
Diferenciálna centrifugácia umožňuje oddeliť obsah buniek, ktoré sa navzájom líšia svojou hmotnosťou.
Rádiografia Je založená na zahrnutí rádioaktívnej značky (napríklad rádioaktívneho jódu, H³-tymidínu atď.) do metabolického procesu.
Morfometria umožňuje merať plochy a objemy buniek, ich jadier a organel pomocou okulárových a objektových mikrometrov a špeciálnych mriežok.
Počítačová aplikácia na automatické spracovanie digitálneho materiálu.
Metóda tkanivovej kultúry je udržiavanie životaschopnosti a delenia buniek a tkanív mimo tela. Na tento účel sa používajú špeciálne nádoby so živným médiom, v ktorých sú vytvorené všetky potrebné podmienky pre životne dôležitú činnosť buniek. Pomocou tejto metódy je možné študovať diferenciáciu a funkčný vývoj buniek, zákonitosti ich malígnej transformácie a vzniku nádorového procesu, medzibunkovú interakciu, poškodenie buniek a tkanív vírusmi a mikroorganizmami, vplyv liečiv na metabolické procesy. procesy v bunkách a tkanivách atď.
Intravitálne (vitálne) farbenie používa sa na štúdium javov fagocytózy a aktivity makrofágov, filtračnej kapacity obličkových tubulov atď.
Metóda transplantácie tkaniva. Táto metóda sa používa na štúdium správania buniek a ich morfofunkčného stavu, keď sú transplantované do iného organizmu. Táto metóda sa napríklad používa na udržiavanie zvierat vystavených smrteľným dávkam žiarenia.
Mikromanipulácia. Táto metóda sa uplatnila v molekulárnej biológii, genetickom inžinierstve a tiež pri klonovaní, kedy sa z vajíčka s haploidnou sadou chromozómov pomocou mikromanipulátora odoberie jadro a do neho sa transplantuje jadro somatickej bunky s diploidnou sadou chromozómov.
Existuje mnoho výskumných metód, medzi ktorými vynikajú: pozorovanie živých embryí pomocou filmu a videozáznamu (využívaného najmä v experimente). Na to sa používa špeciálny mikrofotografický prístroj, ktorý je spojený s tepelnou komorou, v ktorej sa embryo vyvíja. Pri štúdiu vývoja kuracieho embrya napríklad urobíte okno v škrupine, ktoré je uzavreté priehľadnou doskou. Táto metóda umožnila vysledovať a spresniť dynamiku zmien tvaru a veľkosti embryí v procese vývoja.
Metóda pevných rezov embryá pomocou svetelnej a elektrónovej mikroskopie, historiografia, histo- a imunocytochémia. Tieto metódy umožňujú analyzovať tkanivové a intracelulárne zmeny v dynamike vývoja častí embrya. Pomocou histo- a imunocytochemických metód sa študujú biochemické procesy prebiehajúce v embryonálnych bunkách - syntéza DNA, RNA, proteínov, proteínov špecifických receptorov atď. Pomocou týchto metód sa získali dôležité informácie o diferenciácii buniek a tkanív vo vývoji embryí a plodov.
Metóda označovania, ktorú v roku 1925 navrhol W. Vogt (1888-1941), umožňuje študovať pohyby buniek vo vyvíjajúcom sa embryu. Na tento účel sa používajú markery, ktoré sú pre embryá netoxické (napríklad neutrálna červená, častice dreveného uhlia), ako aj protilátky proti určitým proteínom. Pri použití protilátok sa využíva ich schopnosť spájať sa s fluorescenčným farbivom a zárodočnými proteínmi. Pomocou fluorescenčnej mikroskopie sa sleduje distribúcia farbiva a študuje sa dynamika syntézy proteínov vo vyvíjajúcich sa tkanivách embrya.
Mikrochirurgické metódy boli vyvinuté na začiatku 20. storočia predstaviteľmi školy G. Spemanna (1869-1941). Zahŕňali: odstránenie škrupín zo zvieracích vajec, transplantáciu častí jedného embrya do druhého atď. Tieto metódy sa používajú aj na štúdium následkov zničenia (napríklad pomocou laserového lúča) častí embrya alebo jeho jednotlivých bunky. Transplantácia ako druh mikrochirurgie sa používa na identifikáciu dráh migrácie buniek a zdrojov vývoja tkaniva. Súčasne sa miesto embrya, napríklad prepelice, transplantuje na to isté miesto kuracieho embrya namiesto vzdialeného miesta. Jadrá prepeličích buniek majú charakteristickú štruktúru, a preto sú odlíšiteľné od jadier buniek kuracích embryí.
explantácia- excízia malej oblasti embrya a jeho kultivácia v umelom prostredí. Pomocou tejto metódy je možné získať informácie o zdrojoch vývoja tkaniva z danej oblasti embrya a identifikovať histogenetické vzorce vývoja.
Jadrová transplantácia- metóda na klonovanie embryí. Napríklad transplantácia jadier z buniek črevného epitelu žubrienky žaby do žabieho vajíčka, ktorého jadro bolo inaktivované ultrafialovým lúčom, viedla k objaveniu sa nových jedincov (Gerdonove experimenty). Tieto experimenty položili základ pre klonovanie vyšších stavovcov a prispeli k vzhľadu (v roku 1997) slávnej ovce Dolly. Podobné embryologické experimenty presvedčivo ukázali, že jadrá somatických buniek obsahujú kompletný súbor genetických informácií pre vývoj nového organizmu.
Najnovší úspech experimentálna embryológia bol vývoj metódy mimotelového oplodnenia. Transplantácia embryí počatých in vitro do maternice je základom liečby neplodnosti. V roku 1973 L. Shettles (USA) odstránil predovulačné vajíčko z vaječníka neplodnej ženy a oplodnil ho spermiami jej manžela. To bol začiatok techniky transplantácie ľudských embryí s cieľom liečiť neplodnosť. Avšak až v roku 1978 v Spojenom kráľovstve, v dôsledku úspešnej transplantácie neplodnej ženy ľudského embrya v štádiu 8 blastomérov do maternice, po 2,5 dňoch kultivácie, prvé dieťa zo „skúmavky“ na svete vážiace Objavilo sa 2700 g.