Хистологични методи на изследване се използват за изследване на структурата и функцията на клетки и тъкани на хора, животни и растения в нормални, патологични и експериментални условия. Основата на G. m. и. е набор от методологични техники, използвани при производството на препарати от клетки и тъкани за тяхното микроскопско изследване. Микроскопското изследване на клетките и тъканите може да се извърши по два основни начина, в зависимост от състоянието на изследвания обект: изследване на живи клетки и тъкани, изследване на неживи клетки и тъкани, които запазват структурата си поради специална фиксация техники. Изследването на живи обекти - жизнени (суправитални) - позволява да се наблюдават физиологичните процеси в клетките и тъканите, тяхната интравитална структура. Извършва се върху клетки, свободно суспендирани в течна среда (кръвни клетки, епителни клетки от изстъргвания и др.), Както и върху клетъчни и тъканни култури, отглеждани върху специални хранителни среди. Обект на интравитално наблюдение могат да бъдат тънки, прозрачни тъканни филми (, плувна мембрана). В експериментални изследвания се използва методът на биологичните прозорци (имплантиране на прозрачни камери) и изследването на тъканни импланти в естествена прозрачна среда, например в предната камера на окото на животните. В зависимост от задачата се използват различни специални микроскопски методи за жизненоважни изследвания: тъмно поле, фазово-контрастно, флуоресцентно, поляризационно, ултравиолетово. Виталните хистологични методи се използват главно за биологични и биомедицински изследвания. Широкото им използване е ограничено от големи технически трудности, свързани със свойствата на оцелелите тъкани. В медицинските изследвания, особено в практиката на лабораториите по анатомична патология, се използват методи за изследване на неподвижни обекти. Целта на фиксацията е да се запази интравиталната структура на клетките и тъканите чрез бързото им излагане на химични агенти, които предотвратяват развитието на постмортални промени. Изборът на метод за фиксиране зависи от целите на изследването и характеристиките на материала, който трябва да се фиксира. По този начин се използват фиксиращи смеси, съдържащи соли на тежки метали (например сублимат), за идентифициране на тънки клетъчни структури.Най-добрият фиксатор за цитологични цели е осмиевият тетроксид, който често се използва в електронната микроскопия. Универсален фиксатор е формалдехидът, използван под формата на 10% разтвор на формалин. За да бъдат еднородни и цялостни, парченцата тъкан трябва да са малки, а обемът на фиксиращата течност да е многократно по-голям от обема на фиксиращия материал. След фиксиране парчетата обикновено се измиват във вода или алкохол. Твърдите тъканни компоненти (напр. калциеви отлагания) се отстраняват с помощта на техники за декалцификация. Най-бързият и лесен начин за подготовка на тъканен срез, който обикновено се използва в експресната диагностика, е парче и получаване на тъканни срезове върху замразяващ микротом. Въпреки това е трудно да се получат достатъчно тънки срезове, както и срезове от малки предмети и разлагащи се тъкани. Следователно, парчета тъкан, като правило, се изсипват в запечатваща среда - или целоидин. Фиксираният се дехидратира в алкохоли с нарастваща сила, преминава през междинен разтворител (ксилен или за парафин, алкохол-етер за целоидин) и се импрегнира с парафин или целоидин. в парафин ви позволява да получите по-тънки участъци (от 5-8 до 1-2 микрон), отколкото целоидин. Срезовете за микроскопско изследване се приготвят с помощта на слайд или ротационен микротом. Ултра тънки секции (дебелина от 90-100 до 5-15 nm), необходими за електронномикроскопски изследвания, се приготвят на ултратом. Ултратомите се използват и в светлинната микроскопия за получаване на полутънки срезове. Подготвените срезове се оцветяват, за да се подчертаят ясно структурите на клетките и тъканите, които възприемат багрилата по различен начин. Основните багрила - оцветяващи основи и техните соли (толуидиново синьо, лазурно, бисмарково кафяво) - оцветяват така наречените базофилни структури (клетъчни ядра, съединителна тъкан). Киселинни багрила - оцветяващи киселини и техните соли (пикринова киселина, еритрозин) - оцветяват ацидофилни или оксифилни структури (клетъчна цитоплазма, колаген, еластични влакна). оцветяването трябва да се отличава с импрегниране - специален метод, базиран на определени участъци от клетки и тъкани за възстановяване на тежки метали (например сребро, злато, осмий) от техните соли и по този начин придобиване на интензивен цвят. Приготвянето на хистологичния препарат завършва с поставянето му в среди, които осигуряват запазване на структурите на обекта, неговия цвят и прозрачност. Най-често за тези цели се използват например органични смоли.
1. Малка медицинска енциклопедия. - М.: Медицинска енциклопедия. 1991-96 2. Първа помощ. - М.: Велика руска енциклопедия. 1994 3. Енциклопедичен речник на медицинските термини. - М.: Съветска енциклопедия. - 1982-1984 г.
Вижте какво представляват "хистологични методи за изследване" в други речници:
Методически подходи и методи на изследване в анатомията на човека- Понякога се чува, че в анатомията не е останало нищо за изучаване, изследване, уж всички теми са изчерпани, всичко, което може да се изучава, вече е изучено, всички въпроси са решени. Като че ли всичко, което се отнася до структурата на човешкото тяло, ... ... Речник на термините и понятията за човешката анатомия
ЛАБОРАТОРНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ- ЛАБОРАТОРНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ. вижте ЛАБОРАТОРНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ. Най-важното условие за получаване на надеждни резултати от изследването е правилният избор на обекти на анализ, техният навременен избор и формулирането на изследователския проблем. Правила за вземане на проби… Болести по рибите: Наръчник
I Медицина Медицината е система от научни знания и практики, насочени към укрепване и поддържане на здравето, удължаване на живота на хората и предотвратяване и лечение на човешки заболявания. За да изпълни тези задачи, М. изучава структурата и ... ... Медицинска енциклопедия
Начини за изследване на различни обекти с помощта на микроскоп. В биологията и медицината тези методи позволяват да се изследва структурата на микроскопични обекти, чиито размери са извън разделителната способност на човешкото око. Основата на M.m.i. съставляваща…… Медицинска енциклопедия
- (хистологична цитусна клетка + гръцка доктрина за логос) се основава на изследване с помощта на микроскоп на структурните характеристики на клетките, клетъчния състав на тъканните органи, телесните течности на хора и животни при нормални и патологични процеси. В. и ......... Медицинска енциклопедия
I Хистология (гръцки histos тъкан + логос учение) е биомедицинска наука, която изучава еволюцията на тъканите, тяхното развитие в тялото (хистогенеза), структурата, функциите и взаимодействието при многоклетъчните животни и човека. Основният предмет на изучаване на Г. ... ... Медицинска енциклопедия
I Вулва (vulva; pudendum femininum) външни женски полови органи (според Международната анатомична номенклатура на женската полова област). Анатомия и физиология. Вулвата (фиг. 1) е разположена извън срамните кости на таза и е прикрепена към тях ... ... Медицинска енциклопедия
Изучавайки промените, причинени в тялото от различни болестни процеси, тя има за цел чрез присъщите си изследователски методи да определи както тези болестни процеси, така и тяхното значение във връзка с клиничната картина на заболяването и смъртта ... ... Енциклопедичен речник F.A. Brockhaus и I.A. Ефрон
I Биопсия (гръцки bios живот + opsis зрение, зрително възприятие) прижизнено вземане на тъкани, органи или клетъчни суспензии за микроскопско изследване за диагностични цели, както и за изследване на динамиката на патологичния процес и влияние ... ... Медицинска енциклопедия
Наука, която изучава тъканите на животните. Тъканта е група от клетки, които са сходни по форма, размер и функция и по своите метаболитни продукти. Във всички растения и животни, с изключение на най-примитивните, тялото се състои от тъкани, ... ... Енциклопедия на Collier
- (от гръцки ἱστός тъкан и гръцки λόγος знание, дума, наука) клон на биологията, който изучава структурата на тъканите на живите организми. Това обикновено се прави чрез дисекция на тъкан на тънки слоеве и използване на микротом. За разлика от анатомията, ... ... Wikipedia
Книги
- Множествен миелом и плазмени клетъчни заболявания, Рамасами Картик, Лониал Сагар. Книгата представя основните клинични аспекти на множествения миелом и други плазмоцитни заболявания. Описани са лабораторни изследвания, патогенеза, диагностика и лечение. Във втория…
Обектите на изследване могат да бъдат фиксирани (мъртви) или живи клетки и тъкани.
За изследване на микроструктурата на суровини и животински продукти като правило се използват фиксирани клетки и тъкани. Препаратите са временни, предназначени за едно изследване, и постоянни, които могат да се съхраняват и многократно изследват. Освен това се използват тотални или цели препарати.
Временни лекарстваможе да се готви сравнително бързо; за това изследваният материал се фиксира и се получават срезове върху замразяващ микротом; в негово отсъствие може да се направи тънък разрез от тъкан или орган със скалпел или острие. Полученият срез се оцветява, поставя се върху предметно стъкло, след което се нанася капка глицерин и се покрива с покривно стъкло. За откриване на нишесте се използва разтвор на йод в калиев йодид: 0,5 g калиев йодид се разтварят в малко количество вода, добавя се 1 g кристален йод и се добавя вода към 100 cm 3. Няколко капки реактив се нанасят върху тънко парче колбас, сирене и друг материал, разположен върху предметно стъкло, нишестето става синьо-виолетово.
Общо или цели препаратиизследвани без получаване на разрез от тъкан или орган. Например, филм от подкожна тъкан или натрошен препарат от корен на растение след фиксиране, измиване и оцветяване се затваря между предметно стъкло и покривно стъкло. За да се идентифицират отделни структурни елементи, фиксирани и оцветени парчета подкожна тъкан или гладка мускулна тъкан се изтръгват с игла върху предметно стъкло - такива препарати се наричат изтръгнати. В някои случаи, например при изследване на филма на ретината на очната ябълка или кожата на попова лъжица, след фиксиране и измиване не се извършва оцветяване, тъй като клетките съдържат органични включвания (пигмент), които имат естествен цвят.
Метод за приготвяне на хистологичен препарат.Основният метод за изследване на фиксирани клетки и тъкани е хистологичен, т.е. изследване на оцветена тъканна секция, затворена в специална среда. За получаване на срезове се използва изливане на тестовия материал в парафин или целоидин, което дава възможност за получаване на тънки срезове (съответно 5-7 микрона или 10-30 микрона), за бързо приготвяне на срезове (40-60 микрона), замразяване използва се техника.
Основните етапи при подготовката на хистологичния препарат са: вземане на проба, фиксиране, измиване, дехидратация, заливане в парафин или целоидин, оцветяване, поставяне под покривно стъкло.
Избор на пробасе прави, като се вземат предвид целта на изследването и структурата на материала. Размерът на пробата не трябва да надвишава средно 2,5-3,0 см. Пробите от черен дроб и далак се вземат с капсула. Части от атриума се изрязват от сърцето, тъй като мембраните са по-тънки, отколкото във вентрикулите и на един препарат може да се види топографската връзка на епикарда, миокарда и ендокарда. От бъбреците, лимфните възли, надбъбречните жлези се изрязват участъци от органи, които навлизат дълбоко в повърхността перпендикулярно на повърхността, така че върху препарата да се разкрият кората и медулата. Ако е необходимо да се приготвят препарати от променени органи, парчета от тестовия материал се изрязват на границата със засегнатата област, така че преходната зона на лезията да бъде включена в пробата. Проби от скелетни мускули трябва да се изрежат така, че мускулните влакна да са в надлъжни и напречни сечения. Проби от проби от мляно месо, извара и други разпадащи се проби първо се поставят в парче марля и се завързват с конец. Трябва да се има предвид, че при отваряне на гръдната кухина белите дробове се свиват поради еластичността, значително губят въздушност, поради което в трахеята на извлечените дихателни органи се вкарва стъклена или гумена тръба, през която въздухът се инжектира умерено . Копринена лигатура се прилага върху трахеята под поставената тръба и се завързва товар за пълно потапяне. За фиксиране на червата част от органа, предназначена за фиксиране, е предварително превързана с лигатури от двете страни. Пробите са снабдени с дебели хартиени етикети, указващи номера и датата на вземане на пробите.
фиксация,тези. запазването на естествената (жизнена) архитектоника се извършва, за да се прехвърли живата протоплазма на структурите в непроменливо състояние. Действието на фиксаторите се проявява в това, че в резултат на биофизични процеси настъпва необратима коагулация на протеини в тъканите и органите. Тъканната проба, взета от органа, се потапя във фиксатора възможно най-скоро; съотношението на обема на материала и фиксиращата течност трябва да бъде минимум 1:9 (фиг. 3).
Фиксирането води до известно уплътняване и намаляване на обема на пробата. Най-често за фиксиране се използват 10-12% формалин, етилов алкохол, ацетон. За да се приготви посочената концентрация на фиксиращата течност, 40% формалин се разрежда с чешмяна вода. Етилов алкохол (100% абсолютен или 96%) се използва в случаите, когато е необходимо да се идентифицират вещества, които се разтварят във водни фиксатори (например гликоген) в секции. В ацетон изследваният материал (например мозък) се фиксира само за няколко часа. Когато изследваният орган, като костна тъкан, съдържа вар, се извършва декалцификация или калцификация. За да направите това, малко парче кост се спуска (по-добре е да го окачите на конец) в 5-8% воден разтвор на азотна киселина, който се сменя 2-3 пъти на ден. Резултатът от декалцификацията се оценява чрез забождане на тънка игла в костта: ако няма съпротивление, декалцификацията е завършена. След такъв про-
зачервяванесе извършва, за да се отстрани излишното количество фиксатор, например, след фиксиране с формалин, измиването се извършва с течаща чешмяна вода.
Дехидратацияизвършва се за уплътняване на материала в етилов алкохол с нарастваща концентрация: 50-70-100. За да се приготви 50% и 70% алкохол, 96% алкохол се разрежда с дестилирана вода. За да приготвите 100% алкохол, е необходимо да загреете медния сулфат до пълно дехидратиране и да добавите 96% етилов алкохол към дехидратирания бял прах. Във всяка концентрация на алкохол материалът се държи 1-24 часа, в зависимост от размера на парчетата, структурата на органа; в 70% алкохол, материалът може да се съхранява няколко дни.
запълвамсе извършва в такава среда, че тестовата проба става твърда, което прави възможно получаването на тънки срезове. За да направите това, използвайте парафин (импрегниране за 1-4 часа), целоидин (импрегниране за три седмици). При разкриване на мазнини и за изследване на свободни тъкани и органи се използва изливане в желатин.
филийкиполучават на шейни или ротационни микротоми. Най-тънките срезове (5-7 микрона) могат да бъдат направени от материал, вграден в парафин. От материала, напълнен с целоидин, се приготвят срезове с дебелина 15-20 микрона. За изследване на микроструктурата на суровини и продукти от животински произход, като правило, се използва техника на замразяване. Това ускорява подготовката на препарата, тъй като се елиминират дългите етапи на дехидратация и изливане. След фиксиране и измиване, парчетата от обекта се поставят върху мокра платформа на замразяващ микротом и се получават срезове с дебелина 40-60 μm. Участъците се пренасят с четка във водата, където се изправят, придобивайки вид на най-тънките сивкави парчета.
Оцветяване на секцияизвършва се за увеличаване на контраста на различни структури в препарати, предназначени за изследване в светлинен микроскоп. В процеса на оцветяване протичат сложни химични и физични процеси, поради което при избора на метод се взема предвид селективният афинитет на клетъчните структури към определени багрила с различни физикохимични свойства.
Има багрила основни (базални), киселинни и специални. Конструкциите, оцветени с основни багрила, се наричат базофилен,киселинни багрила - оксифилен, ацидофилен, еозинофилен.
От основните (базални) багрила се използва хематоксилин, който оцветява хроматина на ядрото и други структури, съдържащи протеин в синьо или лилаво; кармин, оцветяващ ядрото в светлочервено, сафранин - тъмночервена боя, тионин - синя боя.
От киселинните багрила се използват еозин (оцветява цитоплазмата в розово), пикринова киселина (жълто), фуксин (тухлен цвят), индигокармин (син).
При изследване на микроструктурата на суровини и животински продукти най-често се използва комбинирано оцветяване с хематоксилин и еозин. За да направите това, срезовете от вода се прехвърлят за 1-3 минути в разтвор на хематоксилин; Измива се във вода за 20-30 минути, поставя се в разтвор на еозин за 3-5 минути и се измива с вода за 3-5 минути. Останалата вода се отстранява с филтърна хартия, капва се капка 96% етанол за 1-2 минути и се дехидратира в 25% разтвор на карболова киселина в ксилен или толуол. След това 1-2 капки маточина се нанасят върху порязването и се покриват с покривно стъкло.
От багрилата, които оцветяват мастни включвания, често се използва Судан 111. За да се приготви разтвор на багрило в 95 cm 3 85% етилов алкохол, се добавят 5 cm 3 ацетон и се излива Судан III прах, докато се получи наситен разтвор ( багрилото трябва да се съдържа в излишък). Сместа се загрява до 50% С и се филтрира. Срезове, получени върху микротом за замразяване, се поставят в 50% етанол за 1-2 минути и след това в Судан III за 25 минути. Срезовете се изплакват в 50% алкохол, промиват се с дестилирана вода и се поставят в глицерол-желатин.
Капките неутрална мазнина стават оранжеви поради разтварянето на Судан III в мазнини. Мастни включвания могат да бъдат открити и с осмиева киселина, докато мастните структури се оцветяват в черно.
Заключение под покривното стъклоизвършва се в среди, които не позволяват на въздуха да преминава и са в състояние да запазят разреза за дълго време. Оцветените срезове се дехидратират в алкохоли с нарастваща сила и се поставят под покривно стъкло в ела, канадски балсам или глицерин-желатин (препаратът не трябва да влиза в контакт с алкохоли и ксилен).
Подготовка на препарати за електронна микроскопия.За изследване на биологични обекти се използват два вида електронни микроскопи: трансмисионни (трансмисионни) и сканиращи (растерни).
Принципът на обработка на обект за изследване в трансмисионен електронен микроскоп се основава на същите принципи като при оптичните микроскопи: вземане на проби, фиксиране, измиване, дехидратация, изливане, подготовка на ултратънки срезове, контрастиране.
Избор на пробасе извършва, като се вземат предвид целта на изследването и структурата на материала, при спазване на същите правила, както при светлинна микроскопия. Обемът на парчетата от изследвания материал не трябва да надвишава 1 mm 3 . Основната цел на фиксацията е да запази тъканта възможно най-близо до живота.
ФиксиранеИзвършва се за по-добро запазване на структурите, поради което е необходимо да се използват реагенти с определено рН и изотоничност, чиито стойности се определят от вида на тъканта, която се фиксира. Процесът на фиксиране се извършва на два етапа: префиксация и постфиксация. За предварителна фиксация се използва разтвор на 2,5-3% разтвор на глутаралдехид (рН 7,2-7,4), продължителността на фиксацията е 2-4 часа Постфиксацията се извършва в 2% разтвор (рН 7,2-7,4 ) - 1- 2 часа За запазване на интравиталната структура се препоръчва използването на нискотемпературен фиксатор (0-4 ° C) и приготвяне на фиксатори върху фосфатно-буферни, какодилатни, веронал-ацетатни разтвори.
зачервяванепровежда се с 30% студен спирт 5-7 пъти, обектът се държи във всяка порция спирт по 30 минути, т.е. измити от фиксатора до такова състояние, когато престане окислителното действие на фиксатора.
Дехидратацияизвършва се с етилови алкохоли с нарастваща сила: 30, 50, 70, 96, 100% за 30 минути. За някои методи на изливане се препоръчва добавянето на ацетон и пропилей оксид за обезводняване.
запълвамизвършва се в епоксидни смоли (аралдит, епон и др.). Полимеризацията на смоли в капсули се извършва в термостат при 60 ° C до втвърдяване, като правило, в рамките на 1-2 дни.
Ултратънки секциисе получават с помощта на стъклени ножове на ултрамикротом; за това епоксидните блокове се заточват под формата на тетраедрична пресечена пирамида. Серийни сивкави срезове се поставят във вана с 10% етанол. Получените секции се монтират върху медни или паладиеви мрежи, върху чиято повърхност предварително се нанася формваров филм. За да се разкрият необходимите структури, секциите на мрежите се третират с разтвори на оловен цитрат и уранил ацетат.
За сканираща електронна микроскопиятестовата проба се фиксира, дехидратира, в зависимост от целта на изследването, като се използват горните фиксатори. След дехидратиране пробата се залепва към държач, поставя се в разпръскващ модул и се покрива с много тънък слой злато или платина. За разлика от трансмисионната електронна микроскопия, сканиращата електронна микроскопия може да използва корозивни препарати: обектът на изследване се излива с някои втвърдяващи вещества, след което се изследват отливки и повърхности. Те също така изучават реплики, получени чрез замразяване - чипиране. В този случай се изследва отпечатък от разцепване на повърхността на обекта. За да се увеличи контрастът, репликите трябва да бъдат засенчени чрез пръскане на метални частици (злато, платина) или въглища.
тестови въпроси
- 1. Какви методи се използват при изследване на клетъчни структури, тъкани и органи?
- 2. Какви са основните правила, които трябва да се спазват при вземане на проби за изготвяне на хистологични препарати?
- 3. Какви са особеностите на получаването на препарати от костна тъкан?
- 4. Как се фиксира тестовият материал?
- 5. Какво се използва за дехидратиране на препарати?
- 6. Какви среди се използват за изливане на тестовия материал?
- 7. Каква боя се използва за откриване на мастна тъкан?
- 8. Кой е най-често използваният метод за разделяне и защо?
- 9. Посочете основните етапи на подготовка на препарати за трансмисионна и сканираща електронна микроскопия.
Хистология - ("gistos" на гръцки - тъкан, logis - учение) Това е наука за устройството, развитието и жизнената дейност на тъканите на многоклетъчните организми и човека. Обектите, които са предмет на тази наука, са недостъпни за невъоръжено око. Следователно историята на хистологията е тясно свързана с историята на създаването на такива инструменти, които ни позволяват да изучаваме най-малките обекти с просто око. 2
Курсът на хистологията е условно разделен на следните раздели: n 1. Цитологията е наука за клетката. n 2. Ембриологията е наука за развитието, от зараждането до пълното формиране на организма. n 3. Обща хистология - наука за общите закономерности, присъщи на тъканите. n 4. Частна хистология – изучава строежа, развитието на органите и системите.
ЦИТОЛОГИЯ - (гръцки κύτος "клетка" и λόγος - "изучаване", "наука") n Дял от биологията, който изучава живите клетки, техните органели, тяхната структура, функциониране, процеси на клетъчно възпроизвеждане, стареене и смърт. четири
ЕМБРИОЛОГИЯ n (от др.-гръцки ἔμβρυον - ембрион, ембрион + -λογία от λόγος - учение) е наука, която изучава развитието на ембриона. 5
Историята на създаването на клетъчната теория 1590г. Янсен изобретява микроскопа, в който увеличението се осигурява от свързването на две лещи. 1665 г. Робърт Хук за първи път използва термина клетка. 1650-1700 години. Антъни ван Льовенхук първи описва бактерии и други микроорганизми. 1700-1800 години. Публикувани са много нови описания и рисунки на различни тъкани, предимно растителни. През 1827 г. Карл Баер открива яйцето при бозайниците. 1831-1833 години. Робърт Браун описва ядрото в растителните клетки. 1838-1839 години. Ботаникът Матиас Шлейден и зоологът Теодор Шван комбинират идеите на различни учени и формулират клетъчната теория, която постулира, че основната структурна и функционална единица в живите организми е клетката. 1855 г Рудолф Вирхов показа, че всички клетки се образуват в резултат на клетъчно делене.
Историята на създаването на клетъчната теория 1665г. Изследвайки секция от корк под микроскоп, английският учен, физикът Робърт Хук откри, че се състои от клетки, разделени от прегради. Тези клетки той нарече "клетки"
Историята на създаването на клетъчната теория През 17 век Льовенхук конструира микроскоп и отваря вратата към микрокосмоса за хората. Разнообразие от реснички, ротифери и други миниатюрни живи същества проблеснаха пред очите на удивените изследователи. Оказа се, че те са навсякъде – тези най-малки организми: във водата, оборския тор, във въздуха и праха, в земята и улуците, в гниещите отпадъци от животински и растителен произход.
Историята на създаването на клетъчната теория 1831-1833. Робърт Браун описва ядрото в растителните клетки. През 1838 г. немският ботаник М. Шлейден обръща внимание на ядрото и го смята за източник на клетката. Според Шлейден ядрото се кондензира от гранулирана субстанция, около която се образува ядро, а около ядрото - клетка, като ядрото може да изчезне в процеса на клетъчно образуване.
Историята на създаването на клетъчната теория Немският зоолог Т. Шван показа, че животинските тъкани също се състоят от клетки. Той създава теория, според която клетките, съдържащи ядра, представляват структурната и функционална основа на всички живи същества. Клетъчната теория за структурата е формулирана и публикувана от Т. Шван през 1839 г. Нейната същност може да се изрази в следните разпоредби: 1. Клетката е елементарна структурна единица на структурата на всички живи същества; 2. Клетките на растенията и животните са независими, хомоложни една на друга по произход и устройство. Всяка клетка функционира независимо от другите, но заедно с всички. 3. Всички клетки възникват от безструктурно междуклетъчно вещество. (Грешка!) 4. Жизнената активност на клетката се определя от черупката. (Грешка!)
Историята на създаването на клетъчната теория През 1855 г. немският лекар Р. Вирхов прави обобщение: една клетка може да възникне само от предишна клетка. Това доведе до осъзнаването на факта, че растежът и развитието на организмите са свързани с деленето на клетките и тяхната по-нататъшна диференциация, водеща до образуването на тъкани и органи.
Историята на създаването на клетъчната теория от Карл Баер Още през 1827 г. Карл Баер открива яйцеклетката при бозайниците, доказва, че развитието на бозайниците започва с оплодена яйцеклетка. Това означава, че развитието на всеки организъм започва с едно оплодено яйце, клетката е единица на развитие.
Историята на създаването на клетъчната теория 1865 Публикувани са законите на наследствеността (Г. Мендел). 1868 Открити са нуклеинови киселини (Ф. Мишер) 1873 Открити са хромозоми (Ф. Шнайдер) 1874 Открита е митозата в растителните клетки (И. Д. Чистяков) 1878 Открито е митотичното делене на животински клетки (В. Флеминг, П. И. Перемежко) 1879 Флеминг - поведението на хромозомите по време на делене. 1882 Мейозата е открита в животински клетки (W. Fleming) 1883 Беше показано, че броят на хромозомите в зародишните клетки е два пъти по-малък, отколкото в соматичните клетки (E. Van Beneden) 1887 Мейозата беше открита в растителните клетки (E. Strasburger) 1898 г. Голджи открива мрежестия апарат на клетката, апарата на Голджи. 1914 Хромозомната теория за наследствеността е формулирана (Т. Морган). 1924 Публикувана е естественонаучната теория за произхода на живота на Земята (А. И. Опарин). 1953 г. Формулирани са идеи за структурата на ДНК и е създаден неин модел (Д. Уотсън и Ф. Крик). 1961 Установени са природата и свойствата на генетичния код (Ф. Крик, Л. Барнет, С. Бенър).
Основните положения на съвременната клетъчна теория 1. Клетката е елементарна жива система, структурна единица, жизнена дейност, възпроизводство и индивидуално развитие на организмите. 2. Клетките на всички живи организми са хомоложни, еднакви по структура и произход. 3. Образуване на клетки. Нови клетки възникват само чрез делене на вече съществуващи клетки. 4. Клетка и организъм. Клетката може да бъде независим организъм (прокариоти и едноклетъчни еукариоти). Всички многоклетъчни организми са изградени от клетки. 5. Функции на клетките. В клетките се извършва метаболизъм, раздразнителност и възбудимост, движение, размножаване и диференциация. 6. Клетъчна еволюция. Клетъчната организация възниква в зората на живота и изминава дълъг път на еволюционно развитие от безядрени форми (прокариоти) до ядрени форми (еукариоти).
МЕТОДИ ЗА МИКРОСКОПИЯ НА ХИСТОЛОГИЧНИ ПРЕПАРАТИ 1. Светлинна микроскопия. 2. Ултравиолетова микроскопия. 3. Флуоресцентна (луминесцентна) микроскопия. 4. Фазово-контрастна микроскопия. 5. Микроскопия в тъмно поле. 6. Интерферентна микроскопия 7. Поляризационна микроскопия. 8. Електронна микроскопия. 17
Микроскоп n Този оптичен инструмент ви позволява да наблюдавате малки обекти. Увеличението на изображението се постига чрез система от обективни лещи и окуляр. Огледалото, кондензаторът и диафрагмата насочват светлинния поток и регулират осветеността на обекта. Механичната част на микроскопа включва: статив, предметна маса, макро- и микрометрични винтове, тубусен държач. осемнадесет
Специални методи на микроскопия: - фазово-контрастен микроскоп - (за изследване на живи неоцветени обекти) - микроскопията ви позволява да изследвате живи и неоцветени обекти. Когато светлината преминава през цветни обекти, амплитудата на светлинната вълна се променя, а когато светлината преминава през неоцветени обекти, фазата на светлинната вълна се променя, което се използва за получаване на изображение с висок контраст при фазово-контрастна и интерферентна микроскопия. - микроскоп с тъмно поле (за изследване на живи неоцветени обекти). Използва се специален кондензатор, който подчертава контрастиращите структури на небоядисания материал. Микроскопията с тъмно поле дава възможност да се наблюдават живи обекти. Наблюдаваният обект изглежда осветен в тъмно поле. В този случай лъчите от осветителя падат върху обекта отстрани и само разпръснати лъчи влизат в лещите на микроскопа. 19
Специални методи на микроскопия Luminescent mic-p (за изследване на живи неоцветени обекти) Микроскопията се използва за наблюдение на флуоресцентни (луминесцентни) обекти. Във флуоресцентен микроскоп светлината от мощен източник преминава през два филтъра. Един филтър блокира светлината пред пробата и позволява на светлината с дължина на вълната, която възбужда пробата, да флуоресцира. Другият филтър позволява на светлината с дължината на вълната, излъчвана от флуоресцентния обект, да премине. Така флуоресцентните обекти абсорбират светлина с една дължина на вълната и излъчват светлина в друга област на спектъра. -ултравиолетова способност m-pa) mic-p (увеличава разделителната способност -поляризация mic-p (за изследователски обекти с подредено подреждане на молекули - скелет, мускул, колагенови влакна и др.) микроскопия - формиране на изображение на неоцветени анизотропни структури (като като колагенови влакна и миофибрили).20
Специални методи на микроскопия - интерферентна микроскопия (за определяне на сухия остатък в клетките, определяне на дебелината на обектите) - микроскопията съчетава принципите на фазово-контрастната и поляризационната микроскопия и се използва за получаване на контрастно изображение на неоцветени обекти. Специалната интерферентна оптика (оптика на Номарски) е намерила приложение в микроскопи с диференциален интерферентен контраст. C. Електронна микроскопия: - трансмисия (изследване на обекти чрез трансмисия) - сканиране (изследване на повърхността на обекти) Теоретично разделителната способност на трансмисионна ЕМ е 0,002 nm. Реалната разделителна способност на съвременните микроскопи се доближава до 0,1 nm. За биологични обекти ЕМ резолюцията на практика е 2 nm. 21
Специални техники за микроскопия Трансмисионният електронен микроскоп се състои от колона, през която електроните, излъчени от катодна нишка, преминават във вакуум. През подготвената проба преминава електронен лъч, фокусиран от пръстеновидни магнити. Характерът на разсейването на електроните зависи от плътността на пробата. Електроните, преминаващи през пробата, се фокусират, наблюдават се на флуоресцентен екран и се записват с помощта на фотографска плака. С помощта на сканиращ електронен микроскоп се получава триизмерно изображение на повърхността на изследвания обект. Методът на чипиране (замразяване-разцепване) се използва за изследване на вътрешната структура на клетъчните мембрани. Клетките се замразяват при температура на течен азот в присъствието на криопротектор и се използват за направата на чипове. Равнините на разцепване преминават през хидрофобната среда на липидния двоен слой. Откритата вътрешна повърхност на мембраните е засенчена с платина, получените реплики се изследват в сканиращ ЕМ. 22
Специални (немикроскопски) методи: 1. Цито- или хистохимия - същността е използването на строго специфични химични реакции с лек краен продукт в клетките и тъканите за определяне на количеството на различни вещества (протеини, ензими, мазнини, въглехидрати, и т.н.). Може да се прилага на ниво светлинен или електронен микроскоп. 2. Цитофотометрия - методът се използва в комбинация с 1 и дава възможност за количествено определяне на идентифицирани чрез цитохистохимичния метод протеини, ензими и др.. 3. Авторадиография - в организма се въвеждат вещества, съдържащи радиоактивни изотопи на химични елементи. Тези вещества участват в метаболитните процеси в клетките. Локализацията, по-нататъшното движение на тези вещества в органите се определят върху хистологичните препарати чрез радиация, която се улавя от фотографска емулсия, нанесена върху препарата. 4. Рентгенов дифракционен анализ - ви позволява да определите количеството на химичните елементи в клетките, да изследвате молекулярната структура на биологичните микрообекти. 24 5. Морфометрия - измерване на размера на биол. структури на клетъчно и субклетъчно ниво.
Специални (немикроскопски) методи 6. Микрохирургия - извършване на много деликатни операции с микроманипулатор под микроскоп (трансплантация на ядра, въвеждане на различни вещества в клетките, измерване на биопотенциали и др.) 6. Метод за култивиране на клетки и тъкани - в хранителни среди или в дифузионни камери, имплантирани в различни телесни тъкани. 7. Ултрацентрофугиране - фракциониране на клетки или субклетъчни структури чрез центрофугиране в разтвори с различна плътност. 8. Експериментален метод. 9. Метод за трансплантация на тъкани и органи. 25
Фиксирането запазва структурата на клетките, тъканите и органите, предотвратява тяхното бактериално замърсяване и ензимно смилане и стабилизира макромолекулите чрез тяхното химическо омрежване. 32
Фиксиращ течен формалин, алкохоли, глутаралдехид - Най-често срещаните фиксатори; Криофиксация - Най-доброто запазване на структурите се осигурява чрез моментално замразяване на пробите в течен азот (-196 ° C); Лиофилизация - малки парчета тъкан се подлагат на бързо замразяване, което спира метаболитните процеси. Дехидратация - стандартната процедура за отстраняване на водата е дехидратация в алкохоли с нарастваща сила (от 70 до 60%). Пълнеж - прави тъканта издръжлива, предпазва от смачкване и набръчкване по време на рязане, дава възможност за получаване на разфасовки със стандартна дебелина. Най-разпространената среда за вграждане е парафинът. Използват се също целоидин, пластмасови среди и смоли. 33
Дехидратацията подготвя фиксираната тъкан за проникване на средата за вграждане. Водата от живите тъкани, както и водата от фиксиращите смеси (повечето фиксатори са водни разтвори) трябва да бъдат напълно отстранени след фиксацията. Стандартната процедура за отстраняване на водата е дехидратация в алкохоли, увеличаващи се от 60° до 100°. 34
Попълването е необходима процедура, която предшества подготовката на секциите. Пълнежът прави тъканта издръжлива, предпазва от смачкване и набръчкване по време на рязане и дава възможност за получаване на тънки секции със стандартна дебелина. Най-разпространената среда за вграждане е парафинът. Използват се също целоидин, пластмасови среди и смоли. 35
Ротационен микротом. 40 n Блокове, съдържащи част от орган, са фиксирани в държач за подвижен предмет. Когато се спусне, върху ножа остават серийни срезове, те се отстраняват от ножа и се монтират върху предметно стъкло за по-нататъшна обработка и микроскопия.
Методи за оцветяване на хистосекция: n Нуклеарни (основни): n хематоксилин - оцветява n n n n ядра в синьо; железен хематоксилин; azur II (в лилаво); кармин (в червено); сафранин (в червено); метилово синьо (до синьо); толуидин (в синьо); тионин (в синьо). n Цитоплазма- (киселина): n еозин - в розово; n еритрозин; n оранжево "G" ; n кисел фуксин - до червено; n пикринова киселина - жълта; n Конго - червено - до червено 44
СПЕЦИАЛНИ методи за оцветяване на хистосрезове n Судан III – оранжево оцветяване на липиди и мазнини; n осминова киселина - оцветяване на липидите и мазнините в черно; n orcein - кафяво оцветяване на еластични влакна; n сребърен нитрат - импрегниране на нервни елементи в тъмнокафяв цвят. 45
Клетъчни структури: n OXYPHILIAN способността да се оцветява в розово с киселинни багрила n Basophilian способността да се оцветява в синьо с основни багрила n Neutrophilia - n способността да се оцветява в лилаво с киселинни и основни багрила. 47
1
Клетката n е елементарна жива система, състояща се от цитоплазма, ядро, мембрана и е в основата на развитието, устройството и живота на животинските и растителни организми.
Гликокаликсът е епимембранен комплекс, съставен от протеиново свързани захариди и липидно свързани захариди. Функции n Рецепция (хормони, цитокини, медиатори и антигени) n Междуклетъчни взаимодействия (раздразнителност и разпознаване) n Париетално храносмилане (микровили на чревни гранични клетки)
Функции на цитолемата: - ограничителна; - активен и пасивен транспорт на вещества в двете посоки; - рецепторни функции; контакт със съседни клетки.
Основен Обекти на изследване са хистологични препарати, а основният метод на изследване е микроскопията.
Хистологичният препарат трябва да е достатъчно прозрачен (тънък) и контрастен. Изработен е както от живи, така и от мъртви (неподвижни) конструкции. Препаратът може да бъде суспензия от клетки, натривка, отпечатък, филм, тотален препарат и тънък срез.
Процесът на изготвяне на хистологични препарати за микроскопски изследвания включва следните основни етапи: 1) вземане на материала и фиксирането му; 2) уплътняване на материала; 3) подготовка на секции; 4) оцветяване или контрастни участъци; 5) заключение на раздели.
За оцветяване се използват специални хистологични багрила с различни стойности на pH: киселинни, неутрални и основни. Оцветените от тях структури се наричат съответно оксифилни, неутрофилни (хетерофилни) и базофилни.
Какви методи използва хистологичната наука? Те са многобройни и разнообразни:
Микроскопия.
Светлинна микроскопия. Съвременните микроскопи имат висока разделителна способност. Разделителната способност се определя като най-малкото разстояние (d) между две съседни точки, които могат да се видят отделно. Това разстояние зависи от дължината на светлинната вълна (λ) и се изразява по формулата: d = 1/2 λ.
Минималната дължина на вълната на видимата част от спектъра е 0,4 µm. Следователно разделителната способност на светлинния микроскоп е 0,2 µm, а общото увеличение достига 2500 пъти.
ултравиолетова микроскопия . Дължината на вълната на ултравиолетовата светлина е 0,2 µm, следователно разделителната способност на ултравиолетовия микроскоп е 0,1 µm, но тъй като ултравиолетовото лъчение е невидимо, е необходим луминисцентен екран за наблюдение на изследвания обект.
Флуоресцентна (луминесцентна) микроскопия. Късовълновата (невидима) радиация, погълната от редица вещества, възбужда техните електрони, които излъчват светлина с по-голяма дължина на вълната, превръщайки се във видимата част от спектъра. Така се постига повишаване на разделителната способност на микроскопа.
Фазова контрастна микроскопия ви позволява да излъчвате неоцветени обекти.
Поляризационна микроскопия използвани за изследване на архитектониката на хистологични структури, като колагенови влакна.
електронна микроскопия дава възможност за изследване на обекти, увеличени десетки хиляди пъти.
Микрофотография и микрофилмография . Тези методи позволяват да се изследват неподвижни обекти на снимки и живи микроскопични обекти в движение.
Методи за качествено и количествено изследване.
Хисто –и цитохимия , включително количествен, дава възможност за качествен анализ на изследваните обекти на тъканно, клетъчно и субклетъчно ниво.
Цитоспектрофотометрия Той дава възможност да се изследва количественото съдържание на определени биологични вещества в клетките и тъканите въз основа на абсорбцията на светлина с определена дължина на вълната от свързаното с тях багрило.
Диференциално центрофугиране ви позволява да разделите съдържанието на клетки, които се различават една от друга по своята маса.
Рентгенография Основава се на включването на радиоактивен маркер (например радиоактивен йод, H³-тимидин и др.) в метаболитния процес.
Морфометрия ви позволява да измервате площите и обемите на клетките, техните ядра и органели с помощта на окуляр - и обектни микрометри и специални решетки.
Компютърно приложение за автоматична обработка на дигитален материал.
Метод на тъканна културае поддържането на жизнеспособността и деленето на клетките и тъканите извън тялото. За това се използват специални контейнери с хранителна среда, в които се създават всички необходими условия за жизнената активност на клетките. С помощта на този метод е възможно да се изследват диференциацията и функционалното развитие на клетките, моделите на тяхната злокачествена трансформация и развитието на туморен процес, междуклетъчно взаимодействие, увреждане на клетките и тъканите от вируси и микроорганизми, ефекта на лекарствата върху метаболизма процеси в клетките и тъканите и др.
Интравитално (жизнено) оцветяване използва се за изследване на явленията на фагоцитоза и активността на макрофагите, филтрационния капацитет на бъбречните тубули и др.
Метод за трансплантация на тъкани. Този метод се използва за изследване на поведението на клетките и тяхното морфофункционално състояние при трансплантация в друг организъм. Например, този метод се използва за задържане на животни, изложени на смъртоносни дози радиация.
Микроманипулация.Този метод се използва в молекулярната биология, генното инженерство, а също и в клонирането, когато ядрото се отстранява от яйцеклетка с хаплоиден набор от хромозоми с помощта на микроманипулатор и в него се трансплантира ядро на соматична клетка с диплоиден набор от хромозоми.
Съществува много изследователски методи, сред които се открояват следните: наблюдение на живи ембриони с помощта на филм и видеозапис (използвани основно в експеримента). За целта се използва специално микрофотографско устройство, което е свързано с термична камера, в която се развива ембрионът. Когато изследвате развитието на пилешки ембрион, например, правите прозорец в черупката, който се затваря с прозрачна пластина. Този метод позволи да се проследи и прецизира динамиката на промените във формата и размера на ембрионите в процеса на развитие.
Метод на фиксиран срезембриони с помощта на светлинна и електронна микроскопия, хисторадиоавтография, хисто- и имуноцитохимия. Тези методи позволяват да се анализират тъканни и вътреклетъчни промени в динамиката на развитие на части от ембриона. С помощта на хисто- и имуноцитохимични методи се изследват биохимичните процеси, протичащи в ембрионалните клетки - синтеза на ДНК, РНК, протеини, специфични рецепторни протеини и др. С помощта на тези методи е получена важна информация за клетъчната и тъканна диференциация в развитието на ембриони и фетуси.
Метод на маркиране, предложен през 1925 г. от W. Vogt (1888-1941), дава възможност да се изследват клетъчните движения в развиващия се ембрион. За целта се използват маркери, които не са токсични за ембрионите (например неутрално червено, частици въглен), както и антитела към определени протеини. Когато се използват антитела, се използва способността им да се комбинират с флуоресцентно багрило и зародишни протеини. С помощта на флуоресцентна микроскопия се проследява разпределението на багрилото и се изследва динамиката на протеиновия синтез в развиващите се тъкани на ембриона.
Микрохирургични методиса разработени в началото на 20 век от представители на школата на Г. Шпеман (1869-1941). Те включват: отстраняване на черупките на животински яйца, трансплантация на части от един ембрион в друг и др. Тези методи се използват и за изследване на последствията от унищожаването (например с помощта на лазерен лъч) на части от ембриона или негов индивид клетки. Трансплантацията като вид микрохирургия се използва за идентифициране на пътищата на клетъчна миграция и източниците на развитие на тъканите. В същото време място на ембриона, например пъдпъдък, се трансплантира на същото място на пилешкия ембрион на мястото на отдалеченото място. Клетъчните ядра на пъдпъдъка имат характерна структура и поради това се различават от ядрата на клетките на пилешките ембриони.
експлантация- изрязване на малка част от ембриона и култивирането му в изкуствена среда. С помощта на този метод е възможно да се получи информация за източниците на развитие на тъкани от дадена област на ембриона и да се идентифицират хистогенетични модели на развитие.
Ядрена трансплантация- метод за клониране на ембриони. Например, трансплантацията на ядра от клетките на чревния епител на поповата лъжица на жаба с нокти в яйце на жаба, чието ядро е инактивирано от ултравиолетов лъч, доведе до появата на нови индивиди (експерименти на Гердън). Тези експерименти поставиха началото на клонирането на висши гръбначни животни и допринесоха за появата (през 1997 г.) на известната овца Доли. Подобни ембриологични експерименти убедително показват, че ядрата на соматичните клетки съдържат пълен набор от генетична информация за развитието на нов организъм.
Най-новото постижение експериментална ембриологиябеше развитието на метода за ин витро оплождане. Трансплантацията на ембриони, заченати in vitro, в матката е в основата на лечението на безплодието. През 1973 г. L. Shettles (САЩ) отстранява преовулаторна яйцеклетка от яйчника на безплодна жена и я опложда със сперматозоидите на нейния съпруг. Това е началото на техниката за трансплантация на човешки ембриони за лечение на безплодие. Въпреки това, едва през 1978 г. в Обединеното кралство, в резултат на успешна трансплантация в матката на безплодна жена на човешки ембрион на етап 8 бластомери, след 2,5 дни култивиране, първото в света дете от "епруветка", претеглено Появиха се 2700гр.