Histologinio tyrimo metodai yra naudojami tiriant žmonių, gyvūnų ir augalų ląstelių ir audinių struktūrą ir funkcijas normaliomis, patologinėmis ir eksperimentinėmis sąlygomis. G. m. pagrindas ir. yra – metodinių metodų rinkinys, naudojamas gaminant ląstelių ir audinių preparatus, skirtus jų mikroskopiniam tyrimui. Mikroskopinis ląstelių ir audinių tyrimas gali būti atliekamas dviem pagrindiniais būdais, priklausomai nuo tiriamo objekto būklės: gyvų ląstelių ir audinių tyrimas, negyvų ląstelių ir audinių, kurie išlaiko savo struktūrą dėl specialios fiksacijos, tyrimas. technikos. Gyvų objektų - gyvybinių (supravitalinių) - tyrimas leidžia stebėti fiziologinius procesus ląstelėse ir audiniuose, jų intravitalinę struktūrą. Jis atliekamas su ląstelėmis, laisvai suspenduotomis skystoje terpėje (kraujo ląstelės, epitelio ląstelės ir kt.), Taip pat ląstelių ir audinių kultūrose, auginamose specialiose maistinėse terpėse. Intravitalinio stebėjimo objektas gali būti plonos, skaidrios audinių plėvelės (, plaukimo membrana). Eksperimentiniuose tyrimuose naudojamas biologinių langų metodas (permatomų kamerų implantavimas) ir audinių implantų tyrimas natūralioje skaidrioje aplinkoje, pavyzdžiui, gyvūnų priekinėje akies kameroje. Priklausomai nuo atliekamos užduoties, gyvybiškai svarbiems tyrimams taikomi įvairūs specialūs mikroskopijos metodai: tamsus laukas, fazinis kontrastas, fluorescencija, poliarizacija, ultravioletinė. Gyvybiniai histologiniai metodai daugiausia taikomi biologiniams ir biomedicininiams tyrimams. Jų platų naudojimą riboja dideli techniniai sunkumai, susiję su išlikusių audinių savybėmis. Medicininiuose tyrimuose, ypač anatominės patologijos laboratorijų praktikoje, naudojami fiksuotų objektų tyrimo metodai. Fiksacijos tikslas – išsaugoti intravitalinę ląstelių ir audinių struktūrą, greitai veikiant juos cheminėmis medžiagomis, kurios neleidžia vystytis pomirtiniams pakitimams. Tvirtinimo metodo pasirinkimas priklauso nuo tyrimo tikslų ir tvirtinamos medžiagos savybių. Taigi plonoms ląstelinėms struktūroms identifikuoti naudojami fiksuojantys mišiniai, kuriuose yra sunkiųjų metalų druskų (pavyzdžiui, sublimas).Geriausias fiksatorius citologiniams tikslams yra osmio tetroksidas, kuris dažnai naudojamas elektroninėje mikroskopijoje. Universalus fiksatorius yra formaldehidas, naudojamas 10% formalino tirpalo pavidalu. Kad audinio gabalėliai būtų vienodi ir išsamūs, jie turi būti maži, o fiksuojančio skysčio tūris turi būti daug kartų didesnis už tvirtinamos medžiagos tūrį. Po fiksavimo gabalai dažniausiai nuplaunami vandenyje arba alkoholyje. Kietieji audinių komponentai (pvz., kalcio nuosėdos) pašalinami naudojant kalkių šalinimo metodus. Greičiausias ir lengviausias būdas paruošti audinio pjūvį, dažniausiai naudojamas greitojoje diagnostikoje, yra gabalas ir audinių pjūvių gavimas ant šąlančio mikrotomo. Tačiau sunku gauti pakankamai plonų pjūvių, taip pat pjūvių iš smulkių objektų ir pūvančių audinių. Todėl audinių gabalėliai, kaip taisyklė, pilami į sandarinimo terpę – arba celoidiną. Fiksuotas dehidratuojamas didėjančio stiprumo alkoholiuose, praleidžiamas per tarpinį tirpiklį (ksileną arba parafiną, alkoholio eterį celoidinui) ir impregnuojamas parafinu arba celoidinu. parafine leidžia gauti plonesnes dalis (nuo 5-8 iki 1-2 mikronų) nei celoidinas. Pjūviai mikroskopiniam tyrimui ruošiami stikleliu arba sukamuoju mikrotomu. Itin plonos sekcijos (storis nuo 90-100 iki 5-15 nm) būtini elektronų mikroskopiniams tyrimams, paruošiami ultratomu. Ultratomai taip pat naudojami šviesos mikroskopijoje, norint gauti pusiau plonus pjūvius. Paruošti pjūviai nudažomi, kad aiškiai išryškėtų ląstelių ir audinių struktūras, kurios skirtingai suvokia dažus. Pagrindiniai dažikliai – dažančiosios bazės ir jų druskos (toluidino mėlyna, žydra, bismarko ruda) – nudažo vadinamąsias bazofilines struktūras (ląstelių branduolius, jungiamąjį audinį). Rūgštiniai dažai – dažančiosios rūgštys ir jų druskos (pikrino rūgštis, eritrozinas) – nudažo acidofilines, arba oksifilines, struktūras (ląstelių citoplazmą, kolageną, elastines skaidulas). dažymas turėtų būti atskirtas impregnavimu - specialiu metodu, pagrįstu tam tikromis ląstelių ir audinių sritimis, siekiant atkurti sunkiuosius metalus (pavyzdžiui, sidabrą, auksą, osmį) iš jų druskų ir taip įgauti intensyvią spalvą. Histologinio preparato ruošimas baigiamas dedant į terpes, kurios užtikrina objekto struktūrų, jo spalvos ir skaidrumo išsaugojimą. Dažniausiai šiems tikslams naudojamos, pavyzdžiui, organinės dervos.
1. Mažoji medicinos enciklopedija. - M.: Medicinos enciklopedija. 1991-96 2. Pirmoji pagalba. - M.: Didžioji rusų enciklopedija. 1994 3. Enciklopedinis medicinos terminų žodynas. - M.: Tarybinė enciklopedija. – 1982–1984 m.
Pažiūrėkite, kas yra „histologinio tyrimo metodai“ kituose žodynuose:
Metodiniai metodai ir tyrimo metodai žmogaus anatomijoje– Kartais tenka išgirsti, kad anatomijoje nebėra ko mokytis, tyrinėti, neva visos temos išsemtos, viskas, ką buvo galima studijuoti, jau išstudijuota, visi klausimai išspręsti. Tarsi viskas, kas susiję su žmogaus kūno sandara, ... Žmogaus anatomijos terminų ir sąvokų žodynas
LABORATORINIAI TYRIMAI- LABORATORINIAI TYRIMAI. žr. LABORATORINIAI TYRIMAI. Svarbiausia patikimų tyrimo rezultatų gavimo sąlyga – teisingas analizės objektų pasirinkimas, savalaikis jų parinkimas ir tyrimo problemos suformulavimas. Atrankos taisyklės… Žuvų ligos: vadovas
I Medicina Medicina – tai mokslo žinių ir praktikos sistema, kurios tikslas – stiprinti ir palaikyti sveikatą, pailginti žmonių gyvenimą, užkirsti kelią ir gydyti žmonių ligas. Norėdami atlikti šias užduotis, M. tiria struktūrą ir ... ... Medicinos enciklopedija
Įvairių objektų tyrimo būdai mikroskopu. Biologijoje ir medicinoje šie metodai leidžia ištirti mikroskopinių objektų, kurių matmenys yra už žmogaus akies skiriamosios gebos ribų, struktūrą. M.m.i. sudaro…… Medicinos enciklopedija
- (histologinė cito ląstelė + graikų logotipo doktrina) pagrįsta ląstelių struktūrinių ypatybių, audinių organų ląstelių sudėties, žmonių ir gyvūnų kūno skysčių normalių ir patologinių procesų tyrimu, naudojant mikroskopą. C. ir......... Medicinos enciklopedija
I Histologija (gr. histos audinys + logos mokymas) – biomedicinos mokslas, tiriantis audinių evoliuciją, jų vystymąsi organizme (histogenezę), struktūrą, funkcijas ir sąveiką daugialąsčių gyvūnų ir žmonių organizme. Pagrindinis studijų dalykas G. ... Medicinos enciklopedija
I Vulva (vulva; pudendum femininum) išoriniai moters lytiniai organai (pagal Tarptautinę anatominę nomenklatūrą moters lytinių organų sritis). Anatomija ir fiziologija. Vulva (1 pav.) yra už dubens gaktos kaulų ir pritvirtinta prie jų ... ... Medicinos enciklopedija
Tyrinėdamas įvairių ligų procesų organizme sukeliamus pokyčius, jam būdingais tyrimo metodais siekiama nustatyti tiek šiuos ligos procesus, tiek jų reikšmę klinikiniam ligos ir mirties paveikslui ... Enciklopedinis žodynas F.A. Brockhausas ir I.A. Efronas
I Biopsija (gr. bios life + opsis matymas, regos suvokimas) intravitalinis audinių, organų ar ląstelių suspensijų paėmimas mikroskopiniam tyrimui diagnostikos tikslais, taip pat patologinio proceso dinamikai ir įtakai ištirti ... ... Medicinos enciklopedija
Mokslas, tiriantis gyvūnų audinius. Audinys yra ląstelių, kurios yra panašios formos, dydžio ir funkcijos bei medžiagų apykaitos produktais, grupė. Visų augalų ir gyvūnų, išskyrus pačius primityviausius, kūną sudaro audiniai, ... ... Collier enciklopedija
– (iš graikų ἱστός audinys ir graikų λόγος žinios, žodis, mokslas) biologijos šaka, tirianti gyvų organizmų audinių sandarą. Paprastai tai daroma išpjaustant audinį į plonus sluoksnius ir naudojant mikrotomą. Skirtingai nei anatomija, ... ... Vikipedija
Knygos
- Išsėtinė mieloma ir plazmos ląstelių ligos, Ramasami Kartik, Lonial Sagar. Knygoje pateikiami pagrindiniai daugybinės mielomos ir kitų plazmos ląstelių ligų klinikiniai aspektai. Aprašomi laboratoriniai tyrimai, patogenezė, diagnostika ir gydymas. Antroje…
Tyrimo objektai gali būti fiksuotos (negyvos) arba gyvos ląstelės ir audiniai.
Žaliavų ir gyvulininkystės produktų mikrostruktūrai tirti paprastai naudojamos fiksuotos ląstelės ir audiniai. Preparatai yra laikini, skirti vienam tyrimui, ir nuolatiniai, kuriuos galima saugoti ir pakartotinai tirti. Be to, naudojami visi arba visi preparatai.
Laikini narkotikai galima palyginti greitai virti; už tai tiriama medžiaga fiksuojama ir pjūviai gaunami ant stingdančio mikrotomo, o jei jo nėra, skalpeliu ar ašmenimis galima padaryti ploną audinio ar organo atkarpą. Gauta dalis nudažoma, uždedama ant stiklelio, po to užlašinamas lašelis glicerino ir uždengiamas dengiamuoju stikleliu. Krakmolui aptikti naudojamas jodo tirpalas kalio jodide: 0,5 g kalio jodido ištirpinama nedideliame kiekyje vandens, įpilama 1 g kristalinio jodo ir į 100 cm 3 įpilama vandens. Keli lašai reagento užlašinami ant plono gabalėlio dešros, sūrio ir kitos medžiagos, esančios ant stiklelio, krakmolas pasidaro mėlynai violetinis.
Visi arba visi preparatai ištirtas negaunant audinio ar organo pjūvio. Pavyzdžiui, poodinio audinio plėvelė arba susmulkintas augalo šaknies preparatas po fiksavimo, plovimo ir dažymo yra tarp stiklelio ir dengiamojo stiklelio. Atskiriems struktūriniams elementams identifikuoti ant stiklelio adata nupešiami fiksuoti ir dėmėti poodinio audinio arba lygiųjų raumenų audinio gabalėliai – tokie preparatai vadinami pešiojamais. Kai kuriais atvejais, pavyzdžiui, tiriant akies obuolio tinklainės plėvelę ar buožgalvio odą, po fiksavimo ir plovimo dažymas neatliekamas, nes ląstelėse yra natūralios spalvos organinių intarpų (pigmento).
Histologinio preparato paruošimo būdas. Pagrindinis fiksuotų ląstelių ir audinių tyrimo metodas yra histologinis, t.y. nudažyto audinio pjūvio, uždaryto specialioje terpėje, tyrimas. Pjūviams gauti naudojamas tiriamosios medžiagos supylimas į parafiną arba celoidiną, todėl galima gauti plonus pjūvius (atitinkamai 5-7 mikronų arba 10-30 mikronų), greitam pjūvių paruošimui (40-60 mikronų), užšaldymas. naudojama technika.
Pagrindiniai histologinio mėginio paruošimo etapai yra: mėginių ėmimas, fiksavimas, plovimas, dehidratacija, įterpimas į parafiną arba celoidiną, dažymas, padėjimas po dengiamuoju stikleliu.
Mėginio pasirinkimas daroma atsižvelgiant į tyrimo tikslą ir medžiagos struktūrą. Mėginio dydis vidutiniškai neturi viršyti 2,5-3,0 cm Kepenų ir blužnies mėginiai imami su kapsule. Iš širdies išpjaunami prieširdžio gabalai, nes membranos yra plonesnės nei skilvelių ir ant vieno preparato matosi epikardo, miokardo ir endokardo topografinis ryšys. Iš inkstų, limfmazgių, antinksčių išpjaunamos organų dalys, kurios eina giliai į paviršių statmenai paviršiui, kad preparate atsiskleistų žievė ir meduliai. Jei reikia paruošti pakitusių organų preparatus, tiriamosios medžiagos gabaliukai išpjaunami ties pažeista vieta, kad į mėginį būtų įtraukta pažeidimo pereinamoji zona. Skeleto raumenų mėginiai turi būti nupjauti taip, kad raumenų skaidulos būtų išilginėje ir skersinėje pjūviuose. Maltos mėsos, varškės ir kitų byrančių mėginių pavyzdžiai pirmiausia dedami į marlės gabalėlį ir surišami siūlu. Reikėtų nepamiršti, kad atidarius krūtinės ertmę, plaučiai griūva dėl elastingumo, žymiai prarasdami orumą, todėl į ištrauktų kvėpavimo organų trachėją įkišamas stiklinis arba guminis vamzdelis, per kurį vidutiniškai įpurškiamas oras. . Ant trachėjos po įkištu vamzdeliu uždedamas šilko raištis ir pririšama apkrova visiškai panardinti. Norėdami pritvirtinti žarnas, fiksuoti skirta organo dalis iš abiejų pusių iš anksto sutvarstoma raiščiais. Mėginiai pateikiami su storo popieriaus etiketėmis, kuriose nurodomas mėginių paėmimo numeris ir data.
fiksacija, tie. vykdomas natūralios (gyvenimo) architektonikos išsaugojimas, siekiant perkelti gyvąją konstrukcijų protoplazmą į nekintančią būseną. Fiksatorių veikimas pasireiškia tuo, kad dėl biofizinių procesų audiniuose ir organuose vyksta negrįžtamas baltymų krešėjimas. Iš organo paimtas audinio mėginys kuo greičiau panardinamas į fiksatorių; medžiagos ir tvirtinimo skysčio tūrio santykis turi būti ne mažesnis kaip 1:9 (3 pav.).
Fiksacija sukelia tam tikrą sutankinimą ir mėginio tūrio sumažėjimą. Dažniausiai fiksavimui naudojamas 10-12% formalinas, etilo alkoholis, acetonas. Norint paruošti nurodytos koncentracijos fiksavimo skystį, 40% formalino skiedžiamas vandeniu iš čiaupo. Etilo alkoholis (100 % absoliutus arba 96 %) naudojamas tais atvejais, kai reikia identifikuoti medžiagas, kurios tirpsta vandeniniuose fiksatoriuose (pavyzdžiui, glikogene) skyriuose. Acetone tiriama medžiaga (pavyzdžiui, smegenys) fiksuojama tik kelias valandas. Kai tiriamame organe, pavyzdžiui, kauliniame audinyje, yra kalkių, atliekamas kalcifikavimas arba kalcifikacija. Tam nedidelis kaulo gabalėlis nuleidžiamas (geriau pakabinti ant siūlo) 5-8% vandeniniame azoto rūgšties tirpale, kuris keičiamas 2-3 kartus per dieną. Kalkių šalinimo rezultatas vertinamas įsmeigus į kaulą ploną adatą: jei nėra pasipriešinimo, nukalkinimas baigiamas. Po tokio pro-
paraudimas atliekama siekiant pašalinti perteklinį fiksatoriaus kiekį, pavyzdžiui, po fiksavimo formalinu, plovimas atliekamas tekančiu vandeniu iš čiaupo.
Dehidratacija atliekama sutankinti medžiagą didėjančios koncentracijos etilo alkoholyje: 50-70-100. Norint paruošti 50% ir 70% alkoholio, 96% alkoholis skiedžiamas distiliuotu vandeniu. Norint paruošti 100 % alkoholį, reikia pakaitinti vario sulfatą iki visiško dehidratacijos ir į dehidratuotus baltus miltelius įpilti 96 % etilo alkoholio. Kiekvienoje alkoholio koncentracijoje medžiaga laikoma 1-24 valandas, priklausomai nuo gabalų dydžio, organo struktūros; 70% alkoholio medžiaga gali būti laikoma keletą dienų.
užpildyti yra atliekama tokioje terpėje, kad tiriamasis mėginys taptų kietas, todėl galima gauti plonų pjūvių. Norėdami tai padaryti, naudokite parafiną (impregnavimas 1-4 valandas), celoidiną (impregnavimas tris savaites). Atskleidžiant riebalus ir tiriant laisvus audinius bei organus, pilamas į želatiną.
griežinėliais gauti ant rogių arba rotacinių mikrotomų. Ploniausios dalys (5-7 mikronai) gali būti pagamintos iš medžiagos, įterptos į parafiną. Iš medžiagos, užpildytos celoidinu, ruošiamos 15-20 mikronų storio pjūviai. Žaliavų ir gyvūninės kilmės produktų mikrostruktūrai tirti paprastai naudojama užšaldymo technika. Tai pagreitina preparato paruošimą, nes pašalinami ilgi dehidratacijos ir išpylimo etapai. Po fiksavimo ir plovimo objekto gabalai dedami ant drėgnos šaldymo mikrotomo stadijos ir gaunamos 40-60 μm storio pjūviai. Pjūviai šepetėliu perkeliami į vandenį, kur išsitiesina ir įgauna ploniausių pilkšvų drožlių išvaizdą.
Pjūvio dažymas atliekami siekiant padidinti įvairių struktūrų kontrastą preparatuose, skirtuose tirti šviesos mikroskopu. Dažymo procese vyksta sudėtingi cheminiai ir fiziniai procesai, todėl renkantis metodą atsižvelgiama į ląstelių struktūrų selektyvų giminingumą tam tikriems dažams, turintiems skirtingas fizikines ir chemines savybes.
Yra bazinių (bazinių), rūgščių ir specialių dažiklių. Baziniais dažais nudažytos konstrukcijos vadinamos bazofilinis, rūgštiniai dažai - oksifilinis, acidofilinis, eozinofilinis.
Iš pagrindinių (bazinių) dažų naudojamas hematoksilinas, kuris mėlyna arba violetine spalva nudažo branduolio chromatiną ir kitas baltymo turinčias struktūras; karminas, nudažantis šerdį šviesiai raudona spalva, safraninas – tamsiai raudonais dažais, tioninas – mėlynais dažais.
Iš rūgščių dažų naudojamas eozinas (nudažo citoplazmą rožine spalva), pikrino rūgštis (geltona), fuksinas (plytų spalva), indigokarminas (mėlyna).
Tiriant žaliavų ir gyvulininkystės produktų mikrostruktūrą, dažniausiai naudojamas kombinuotas dažymas hematoksilinu ir eozinu. Norėdami tai padaryti, sekcijos iš vandens 1-3 minutes perkeliamos į hematoksilino tirpalą; 20-30 minučių plaunama vandenyje, 3-5 minutes dedama į eozino tirpalą ir 3-5 minutes plaunama vandeniu. Likęs vanduo pašalinamas filtravimo popieriumi, 1-2 minutes užlašinamas lašas 96% etanolio ir dehidratuojamas 25% karbolio rūgšties tirpale ksilene arba toluene. Tada ant pjūvio užlašinami 1-2 lašai balzamo ir uždengiami dengiamuoju stikleliu.
Iš dažų, dažančių riebalų intarpus, dažnai naudojamas Sudan 111. Dažų tirpalui paruošti 95 cm 3 85 % etilo alkoholio įpilama 5 cm 3 acetono ir pilama Sudano III miltelių, kol gaunamas sotus tirpalas ( dažų turi būti per daug). Mišinys pašildomas iki 50 % C ir filtruojamas. Pjūviai, gauti ant šaldymo mikrotomo, 1-2 minutėms dedami į 50 % etanolį, o po to 25 minutėms į Sudaną III. Pjūviai nuplaunami 50% spiritu, nuplaunami distiliuotu vandeniu ir įterpiami į glicerolio želatiną.
Neutralių riebalų lašai nusidažo oranžine spalva, nes riebaluose ištirpsta Sudanas III. Riebalų intarpus taip pat galima aptikti naudojant osminę rūgštį, o riebalinės struktūros nusidažo juodai.
Išvada po dangteliu atliekama aplinkoje, kuri nepraleidžia oro ir gali išlaikyti pjūvį ilgą laiką. Beicuotos sekcijos dehidratuojamos didėjančio stiprumo alkoholiuose ir dedamos po dengiamuoju stikleliu į eglę, Kanados balzamą arba glicerolio želatiną (preparatas neturi liestis su alkoholiais ir ksilenu).
Mėginių paruošimas elektroninei mikroskopijai. Biologiniams objektams tirti naudojami dviejų tipų elektroniniai mikroskopai: perdavimo (perdavimo) ir skenavimo (rastrinis).
Objekto apdorojimo, skirto tirti perdavimo elektroniniu mikroskopu, principas grindžiamas tais pačiais principais kaip ir optiniuose mikroskopuose: mėginių ėmimas, fiksavimas, plovimas, dehidratacija, pilimas, itin plonų pjūvių paruošimas, kontrastavimas.
Mėginio pasirinkimas atliekama atsižvelgiant į tyrimo tikslą ir medžiagos struktūrą, laikantis tų pačių taisyklių kaip ir atliekant šviesos mikroskopiją. Tiriamos medžiagos gabalų tūris neturi viršyti 1 mm 3 . Pagrindinis fiksavimo tikslas – išlaikyti audinį kuo arčiau gyvybės.
Fiksavimas Tai atliekama siekiant geriau išsaugoti struktūras, todėl būtina naudoti tam tikro pH ir izotoniškumo reagentus, kurių reikšmes lemia fiksuojamo audinio tipas. Fiksavimo procesas vyksta dviem etapais: prefiksacija ir postfiksacija. Prefiksacijai naudojamas 2,5-3% glutaraldehido tirpalas (pH 7,2-7,4), fiksacijos trukmė 2-4 val. Postfiksacija atliekama 2% tirpale (pH 7,2-7,4) - 1- 2 val.Intravitalinei struktūrai išsaugoti rekomenduojama naudoti žematemperatūrį fiksatorių (0-4 °C), fiksatorius ruošti ant fosfatinio-buferinio, kakodilato, veronalio-acetato tirpalų.
paraudimas atliekama su 30% šaltu spiritu 5-7 kartus, daiktas kiekvienoje spirito porcijoje laikomas po 30 min., t.y. nuplaunamas iš fiksatoriaus į tokią būseną, kai nutrūksta fiksatoriaus oksidacinis veikimas.
Dehidratacija atlikti su didėjančio stiprumo etilo alkoholiais: 30, 50, 70, 96, 100 % 30 minučių. Kai kuriems išpylimo būdams nusausinimui rekomenduojama pridėti acetono ir propileno oksido.
užpildyti atliekamas epoksidinėse dervose (aralditas, eponas ir kt.). Dervų polimerizacija kapsulėse vyksta termostate 60 °C temperatūroje iki sukietėjimo, kaip taisyklė, per 1-2 dienas.
Itin plonos sekcijos yra gaunami naudojant stiklinius peilius ant ultramikrotomo; tam epoksidiniai blokai yra pagaląsti tetraedrinės nupjautos piramidės pavidalu. Serijiniai pilkšvi skyriai dedami į vonią su 10% etanolio. Gautos sekcijos montuojamos ant vario arba paladžio tinklelio, ant kurio paviršiaus iš anksto uždedama formvaro plėvelė. Norint atskleisti reikiamas struktūras, tinklelių sekcijos apdorojamos švino citrato ir uranilacetato tirpalais.
Dėl skenuojanti elektroninė mikroskopija tiriamasis mėginys fiksuojamas, dehidratuojamas, priklausomai nuo tyrimo tikslo, naudojant minėtus fiksatorius. Po dehidratacijos mėginys priklijuojamas prie laikiklio, įdedamas į purškimo įrenginį ir padengiamas labai plonu aukso arba platinos sluoksniu. Skirtingai nuo transmisinės elektroninės mikroskopijos, skenuojančioje elektroninėje mikroskopijoje gali būti naudojami koroziniai preparatai: tiriamasis objektas užpilamas kai kuriomis kietėjančiomis medžiagomis, o tada tiriami liejiniai ir paviršiai. Jie taip pat tiria replikas, gautas šaldant – čipuojant. Šiuo atveju tiriamas objekto paviršiaus skilimo įspūdis. Norint padidinti kontrastą, kopijos turi būti nuspalvintos purškiant metalo daleles (auksą, platiną) arba anglis.
testo klausimai
- 1. Kokie metodai taikomi tiriant ląstelių struktūras, audinius ir organus?
- 2. Kokių pagrindinių taisyklių reikia laikytis imant mėginius histologiniams preparatams ruošti?
- 3. Kokie yra preparatų ruošimo iš kaulinio audinio ypatumai?
- 4. Kaip tvirtinama bandomoji medžiaga?
- 5. Kas naudojamas preparatams dehidratuoti?
- 6. Kokios terpės naudojamos tiriamajai medžiagai pilti?
- 7. Kokie dažai naudojami riebaliniam audiniui aptikti?
- 8. Koks yra dažniausiai naudojamas skilimo būdas ir kodėl?
- 9. Įvardykite pagrindinius bandinių paruošimo perdavimo ir skenuojamosios elektroninės mikroskopijos etapus.
Histologija – („gistos“ graikiškai – audinys, logis – mokymas) Tai mokslas apie daugialąsčių organizmų ir žmonių audinių sandarą, vystymąsi ir gyvybinę veiklą. Objektai, kurie yra šio mokslo objektas, yra neprieinami plika akimi. Todėl histologijos istorija yra glaudžiai susijusi su tokių instrumentų, leidžiančių plika akimi tirti mažiausius objektus, sukūrimo istorija. 2
Histologijos eiga sutartinai skirstoma į tokias dalis: n 1. Citologija yra mokslas apie ląstelę. n 2. Embriologija – mokslas apie vystymąsi, nuo atsiradimo iki visiško organizmo susiformavimo. n 3. Bendroji histologija – mokslas apie bendruosius audinius būdingus modelius. n 4. Privati histologija – tiria organų ir sistemų sandarą, raidą.
CITOLOGIJA – (gr. κύτος „ląstelė“ ir λόγος – „tyrimas“, „mokslas“) n Biologijos šaka, tirianti gyvas ląsteles, jų organelius, jų struktūrą, funkcionavimą, ląstelių dauginimosi, senėjimo ir mirties procesus. keturi
EMBRIOLOGIJA n (iš kitų -gr. ἔμβρυον - embrionas, embrionas + -λογία iš λόγος - mokymas) yra mokslas, tiriantis embriono vystymąsi. 5
Ląstelių teorijos sukūrimo istorija 1590 m. Jansenas išrado mikroskopą, kuriame padidinimas buvo suteiktas sujungus du lęšius. 1665 m. Robertas Hukas pirmą kartą pavartojo terminą ląstelė. 1650-1700 metų. Anthony van Leeuwenhoek pirmą kartą aprašė bakterijas ir kitus mikroorganizmus. 1700-1800 metų. Paskelbta daug naujų įvairių audinių, daugiausia augalinių, aprašymų ir brėžinių. 1827 m. Karlas Baeris atrado žinduolių kiaušinį. 1831-1833 metai. Robertas Brownas aprašė branduolį augalų ląstelėse. 1838-1839 metai. Botanikas Matthiasas Schleidenas ir zoologas Theodoras Schwannas sujungė skirtingų mokslininkų idėjas ir suformulavo ląstelių teoriją, teigiančią, kad pagrindinis gyvų organizmų struktūros ir funkcijos vienetas yra ląstelė. 1855 m Rudolfas Virchovas parodė, kad visos ląstelės susidaro dėl ląstelių dalijimosi.
Ląstelių teorijos sukūrimo istorija 1665 m. Mikroskopu ištyręs kamštienos pjūvį, anglų mokslininkas, fizikas Robertas Hukas išsiaiškino, kad jį sudaro pertvaromis atskirtos ląstelės. Šias ląsteles jis pavadino „ląstelėmis“
Ląstelių teorijos sukūrimo istorija XVII amžiuje Leeuwenhoekas sukūrė mikroskopą ir atvėrė žmonėms duris į mikrokosmosą. Nustebusių tyrinėtojų akyse blykstelėjo daugybė blakstienų, rotiferių ir kitų mažyčių gyvų būtybių. Paaiškėjo, kad jų yra visur – šie mažiausi organizmai: vandenyje, mėšle, ore ir dulkėse, žemėje ir latakuose, pūvančiose gyvulinės ir augalinės kilmės atliekose.
Ląstelių teorijos sukūrimo istorija 1831-1833 m. Robertas Brownas aprašė branduolį augalų ląstelėse. 1838 metais vokiečių botanikas M. Schleidenas atkreipė dėmesį į branduolį ir laikė jį ląstelės pradininku. Schleideno teigimu, iš granuliuotos medžiagos kondensuojasi branduolys, aplink kurį susidaro branduolys, o aplink branduolį – ląstelė, o ląstelės formavimosi procese branduolys gali išnykti.
Ląstelių teorijos sukūrimo istorija Vokiečių zoologas T. Schwannas įrodė, kad gyvūnų audiniai taip pat susideda iš ląstelių. Jis sukūrė teoriją, teigiančią, kad ląstelės, kuriose yra branduoliai, yra visų gyvų dalykų struktūrinis ir funkcinis pagrindas. Ląstelinę sandaros teoriją suformulavo ir 1839 m. paskelbė T. Schwann. Jos esmė gali būti išreikšta šiomis nuostatomis: 1. Ląstelė yra elementarus struktūrinis visų gyvų būtybių sandaros vienetas; 2. Augalų ir gyvūnų ląstelės yra nepriklausomos, viena kitai homologiškos savo kilme ir struktūra. Kiekviena ląstelė veikia nepriklausomai nuo kitų, bet kartu su visomis. 3. Visos ląstelės kyla iš bestruktūrės tarpląstelinės medžiagos. (Klaida!) 4. Ląstelės gyvybinę veiklą lemia apvalkalas. (Klaida!)
Ląstelių teorijos sukūrimo istorija 1855 metais vokiečių gydytojas R. Virchow padarė apibendrinimą: ląstelė gali atsirasti tik iš ankstesnės ląstelės. Tai paskatino suvokti, kad organizmų augimas ir vystymasis yra susiję su ląstelių dalijimusi ir tolimesne jų diferenciacija, dėl kurios susidaro audiniai ir organai.
Karlo Baerio ląstelių teorijos sukūrimo istorija Dar 1827 m. Karlas Baeris atrado žinduolių kiaušinėlį, įrodė, kad žinduolių vystymasis prasideda nuo apvaisinto kiaušinėlio. Tai reiškia, kad bet kurio organizmo vystymasis prasideda nuo vieno apvaisinto kiaušinėlio, ląstelė yra vystymosi vienetas.
Ląstelių teorijos sukūrimo istorija 1865 m. Paskelbti paveldimumo dėsniai (G. Mendelis). 1868 Atrastos nukleino rūgštys (F. Miescher) 1873 Atrastos chromosomos (F. Schneideris) 1874 Augalų ląstelėse aptikta mitozė (I. D. Chistyakov) 1878 Aptiktas mitozinis gyvūnų ląstelių dalijimasis (W. Flemingas, P. I. Peremezhko) 187 Flemingas – chromosomų elgesys dalijimosi metu. 1882 Mejozė aptikta gyvūnų ląstelėse (W. Fleming) 1883 Nustatyta, kad lytinėse ląstelėse chromosomų skaičius yra du kartus mažesnis nei somatinėse ląstelėse (E. Van Beneden) 1887 Mejozė aptikta augalų ląstelėse (E. Strasburger ) 1898 m. Golgi atrado ląstelės tinklinį aparatą, Golgi aparatą. 1914 m. Suformuluota chromosomų paveldimumo teorija (T. Morganas). 1924 m. paskelbta gamtamokslinė gyvybės atsiradimo Žemėje teorija (A. I. Oparinas). 1953 Suformuluotos idėjos apie DNR struktūrą ir sukurtas jos modelis (D. Watson ir F. Crick). 1961 Nustatoma genetinio kodo prigimtis ir savybės (F. Crick, L. Barnet, S. Benner).
Pagrindinės šiuolaikinės ląstelių teorijos nuostatos 1. Ląstelė – elementari gyvoji sistema, organizmų sandaros, gyvybinės veiklos, dauginimosi ir individualaus vystymosi vienetas. 2. Visų gyvų organizmų ląstelės yra homologinės, vienodos sandaros ir kilmės. 3. Ląstelių susidarymas. Naujos ląstelės atsiranda tik dalijantis jau egzistuojančias ląsteles. 4. Ląstelė ir organizmas. Ląstelė gali būti nepriklausomas organizmas (prokariotai ir vienaląsčiai eukariotai). Visi daugialąsčiai organizmai susideda iš ląstelių. 5. Ląstelių funkcijos. Ląstelėse vyksta medžiagų apykaita, dirglumas ir jaudrumas, judėjimas, dauginimasis ir diferenciacija. 6. Ląstelių evoliucija. Ląstelių organizacija atsirado gyvybės aušroje ir nuėjo ilgą evoliucinio vystymosi kelią nuo formų be branduolių (prokariotų) iki branduolinių formų (eukariotų).
HISTOLOGIJŲ BANDINIŲ MIKROSKOPAVIMO METODAI 1. Šviesos mikroskopija. 2. Ultravioletinė mikroskopija. 3. Fluorescencinė (liuminescencinė) mikroskopija. 4. Fazinė kontrastinė mikroskopija. 5. Tamsiojo lauko mikroskopija. 6. Interferencinė mikroskopija 7. Poliarizacinė mikroskopija. 8. Elektroninė mikroskopija. 17
Mikroskopas n Šis optinis prietaisas leidžia stebėti mažus objektus. Vaizdo padidinimas pasiekiamas naudojant objektyvų lęšių ir okuliaro sistemą. Veidrodis, kondensatorius ir diafragma nukreipia šviesos srautą ir reguliuoja objekto apšvietimą. Mechaninėje mikroskopo dalyje yra: trikojis, objektų stalas, makro ir mikrometriniai varžtai, vamzdelio laikiklis. aštuoniolika
Specialūs mikroskopijos metodai: - fazinis kontrastinis mikroskopas - (skirtas gyvų nedažytų objektų tyrimui) - mikroskopija leidžia tirti gyvus ir nedažytus objektus. Kai šviesa praeina per spalvotus objektus, keičiasi šviesos bangos amplitudė, o kai šviesa praeina per nespalvotus objektus, keičiasi šviesos bangos fazė, kuri naudojama didelio kontrasto vaizdui gauti atliekant fazinio kontrasto ir trukdžių mikroskopiją. - tamsaus lauko mikroskopas (gyviems nedažytiems objektams tirti). Naudojamas specialus kondensatorius, kuris išryškina kontrastingas nedažytos medžiagos struktūras. Tamsiojo lauko mikroskopija leidžia stebėti gyvus objektus. Stebimas objektas atrodo kaip apšviestas tamsiame lauke. Tokiu atveju apšvietimo įrenginio spinduliai krenta ant objekto iš šono, o į mikroskopo lęšius patenka tik išsklaidyti spinduliai. 19
Specialūs mikroskopijos metodai Liuminescencinis mic-p (gyvų nedažytų objektų tyrimui) Mikroskopija naudojama fluorescenciniams (liuminescenciniams) objektams stebėti. Fluorescenciniame mikroskope galingo šaltinio šviesa praeina per du filtrus. Vienas filtras blokuoja šviesą prieš mėginį ir leidžia šviesai, kurios bangos ilgis sužadina mėginį, fluorescuoti. Kitas filtras leidžia prasiskverbti pro fluorescencinio objekto skleidžiamo bangos ilgio šviesą. Taigi fluorescenciniai objektai sugeria vieno bangos ilgio šviesą ir skleidžia šviesą kitoje spektro srityje. -ultravioletinis gebėjimas m-pa) mic-p (didina skiriamąją gebą -poliarizacija mic-p (tyrimo objektams su tvarkingu molekulių išsidėstymu - skeletas, raumuo, kolageno skaidulos ir kt.) mikroskopija - nespalvotų anizotropinių struktūrų vaizdo formavimas (pvz. kaip kolageno skaidulos ir miofibrilės).20
Specialūs mikroskopijos metodai – interferencinė mikroskopija (sausajai likučiai ląstelėse nustatyti, objektų storiui nustatyti) – mikroskopija sujungia fazinio kontrasto ir poliarizacinės mikroskopijos principus ir yra naudojama kontrastiniam nedažytų objektų vaizdui gauti. Speciali trukdžių optika (Nomarsky optika) buvo pritaikyta mikroskopuose su diferencinio trukdžių kontrastu. C. Elektroninė mikroskopija: -perdavimas (daiktų tyrimas per perdavimą) -skenavimas (daiktų paviršiaus tyrimas) Teoriškai perdavimo EM skiriamoji geba yra 0,002 nm. Tikroji šiuolaikinių mikroskopų skiriamoji geba artėja prie 0,1 nm. Biologiniams objektams EM skiriamoji geba praktiškai yra 2 nm. 21
Specialūs mikroskopijos metodai Perdavimo elektronų mikroskopas susideda iš kolonėlės, per kurią vakuume praeina katodo gijos skleidžiami elektronai. Per paruoštą mėginį praeina elektronų pluoštas, sufokusuotas žiedo magnetais. Elektronų sklaidos pobūdis priklauso nuo mėginio tankio. Elektronai, praeinantys per mėginį, sufokusuojami, stebimi fluorescenciniame ekrane ir įrašomi naudojant fotografinę plokštelę. Skenuojantis elektroninis mikroskopas naudojamas trimačiui tiriamo objekto paviršiaus vaizdui gauti. Ląstelių membranų vidinei struktūrai tirti taikomas skaldos metodas (užšaldymas-skilimas). Ląstelės užšaldomos skysto azoto temperatūroje, esant krioprotektoriui ir naudojamos lustams gaminti. Skilimo plokštumos eina per hidrofobinį lipidų dvisluoksnio vidurį. Atidengtas vidinis membranų paviršius užtamsintas platina, gautos kopijos tiriamos skenuojančiu EM. 22
Specialūs (nemikroskopiniai) metodai: 1. Cito- arba histochemija - esmė yra griežtai specifinių cheminių reakcijų su lengvu galutiniu produktu panaudojimas ląstelėse ir audiniuose, siekiant nustatyti įvairių medžiagų (baltymų, fermentų, riebalų, angliavandenių, angliavandenių, angliavandenių) kiekį. ir tt). Gali būti taikomas šviesos arba elektroninio mikroskopo lygyje. 2. Citofotometrija - metodas naudojamas kartu su 1 ir leidžia kiekybiškai įvertinti citohistocheminiu metodu identifikuotus baltymus, fermentus ir kt.. 3. Autoradiografija - į organizmą įvedamos medžiagos, turinčios radioaktyvių cheminių elementų izotopų. Šios medžiagos yra įtrauktos į medžiagų apykaitos procesus ląstelėse. Šių medžiagų lokalizacija, tolesnis judėjimas organuose histologiniuose preparatuose nustatomas spinduliuote, kuri fiksuojama preparato užtepama fotografine emulsija. 4. Rentgeno spindulių difrakcinė analizė – leidžia nustatyti cheminių elementų kiekį ląstelėse, ištirti biologinių mikroobjektų molekulinę sandarą. 24 5. Morfometrija – biol dydžio matavimas. struktūros ląstelių ir tarpląsteliniame lygmenyse.
Specialūs (nemikroskopiniai) metodai 6. Mikrourgija - labai subtilių operacijų atlikimas mikromanipuliatoriumi po mikroskopu (branduolių transplantacija, įvairių medžiagų įvedimas į ląsteles, biopotencialų matavimas ir kt.) 6. Ląstelių ir audinių kultivavimo būdas - in maistinėse terpėse arba difuzijos kamerose, implantuojamos į įvairius kūno audinius. 7. Ultracentrifugavimas – ląstelių ar tarpląstelinių struktūrų frakcionavimas centrifuguojant įvairaus tankio tirpaluose. 8. Eksperimentinis metodas. 9. Audinių ir organų transplantacijos metodas. 25
Fiksacija išsaugo ląstelių, audinių ir organų struktūrą, apsaugo nuo jų bakterijų užteršimo ir fermentinio virškinimo bei stabilizuoja makromolekules per jų cheminį kryžminį ryšį. 32
Tvirtinamasis skystas formalinas, alkoholiai, glutaraldehidas – Dažniausiai pasitaikantys fiksatoriai; Kriofiksacija – geriausią konstrukcijų išsaugojimą užtikrina momentinis mėginių užšaldymas skystame azote (-196 °C); Liofilizacija - maži audinio gabalėliai greitai užšaldomi, o tai sustabdo medžiagų apykaitos procesus. Dehidratacija - standartinė vandens pašalinimo procedūra yra dehidratacija didėjančio stiprumo alkoholiuose (nuo 70 iki 60%). Užpildas - daro audinį patvarų, neleidžia jam sutraiškyti ir susiglamžyti pjovimo metu, leidžia gauti standartinio storio pjūvius. Dažniausia įterpimo terpė yra parafinas. Taip pat naudojamas celoidinas, plastikinės terpės ir dervos. 33
Dehidratacija paruošia fiksuotą audinį prasiskverbti į įterpimo terpę. Vanduo iš gyvų audinių, taip pat vanduo iš fiksuojamųjų mišinių (dauguma fiksatorių yra vandeniniai tirpalai) po fiksavimo turi būti visiškai pašalintas. Standartinė vandens pašalinimo procedūra yra dehidratacija alkoholiuose, kurių stiprumas padidinamas nuo 60° iki 100°. 34
Užpildymas yra būtina procedūra, kuri atliekama prieš sekcijų paruošimą. Užpildas daro audinį patvarų, neleidžia jam sutraiškyti ir susiglamžyti pjovimo metu, taip pat galima gauti plonas standartinio storio dalis. Dažniausia įterpimo terpė yra parafinas. Taip pat naudojamas celoidinas, plastikinės terpės ir dervos. 35
Rotacinis mikrotomas. 40 n Blokai, kuriuose yra vargonų gabalas, tvirtinami kilnojamame daiktų laikiklyje. Kai jis nuleidžiamas, ant peilio lieka serijinės sekcijos, jos nuimamos nuo peilio ir uždedamos ant stiklelio tolesniam apdorojimui ir mikroskopavimui.
Histosekcijos dažymo metodai: n Branduolinis (bazinis): n hematoksilinas – nusidažo n n n n branduoliai mėlynai; geležies hematoksilinas; azur II (violetinė spalva); karminas (raudonos spalvos); safraninas (raudona spalva); metilo mėlyna (iki mėlynos spalvos); toluidinas (mėlyna spalva); tioninas (mėlynas). n Citoplazminė- (rūgštis): n eozinas - rožinės spalvos; n eritrozinas; n oranžinė "G" ; n rūgštus fuksinas - iki raudonos spalvos; n pikrino rūgštis - geltona; n Kongas – raudona – raudona 44
SPECIALIEJI histosekcijų dažymo metodai n Sudanas III – lipidų ir riebalų dažymas oranžine spalva; n osminė rūgštis - lipidų ir riebalų dažymas juodai; n orceinas - ruda elastingų pluoštų spalva; n sidabro nitratas - nervų elementų impregnavimas tamsiai ruda spalva. 45
Ląstelių struktūros: n OKSIFILIJA – gebėjimas nudažyti rausvą spalvą rūgštiniais dažais, n bazofilija – gebėjimas nudažyti mėlyna spalva baziniais dažais n Neutrofilija – n gebėjimas dažyti purpurine spalva rūgštiniais ir baziniais dažais. 47
1
Ląstelė n yra elementari gyvoji sistema, susidedanti iš citoplazmos, branduolio, membranos ir yra gyvūnų ir augalų organizmų vystymosi, struktūros ir gyvenimo pagrindas.
Glikokaliksas yra epimembraninis kompleksas, sudarytas iš su baltymais susietų sacharidų ir su lipidais susietų sacharidų. Funkcijos n Priėmimas (hormonai, citokinai, mediatoriai ir antigenai) n Tarpląstelinė sąveika (dirglumas ir atpažinimas) n Parietalinis virškinimas (žarnyno sienelių ląstelių mikrovilis)
Citolemos funkcijos: - ribojančios; - aktyvus ir pasyvus medžiagų pernešimas į abi puses; - receptorių funkcijos; kontaktas su kaimyninėmis ląstelėmis.
Pagrindinis Tyrimo objektai yra histologiniai preparatai, o pagrindinis tyrimo metodas – mikroskopija.
Histologinis preparatas turi būti pakankamai skaidrus (plonas) ir kontrastingas. Jis pagamintas iš gyvų ir negyvų (fiksuotų) struktūrų. Preparatas gali būti ląstelių suspensija, tepinėlis, įspaudas, plėvelė, visas preparatas ir plona dalis.
Histologinių preparatų mikroskopiniams tyrimams ruošimo procesą sudaro šie pagrindiniai žingsniai: 1) medžiagos paėmimas ir fiksavimas; 2) medžiagos tankinimas; 3) sekcijų rengimas; 4) dažymas arba kontrastingos dalys; 5) skyrių išvada.
Dažymui naudojami specialūs histologiniai dažai, kurių pH vertės skiriasi: rūgštinis, neutralus ir bazinis. Jų nudažytos struktūros atitinkamai vadinamos oksifilinėmis, neutrofilinėmis (heterofilinėmis) ir bazofilinėmis.
Kokius metodus taiko histologijos mokslas? Jų yra gana daug ir įvairių:
Mikroskopija.
Šviesos mikroskopija. Šiuolaikiniai mikroskopai turi didelę skiriamąją gebą. Skiriamoji geba apibrėžiama kaip mažiausias atstumas (d) tarp dviejų gretimų taškų, kuriuos galima matyti atskirai. Šis atstumas priklauso nuo šviesos bangos ilgio (λ) ir išreiškiamas formule: d = 1/2 λ.
Mažiausias matomos spektro dalies bangos ilgis yra 0,4 µm. Todėl šviesos mikroskopo skiriamoji geba yra 0,2 µm, o bendras padidinimas siekia 2500 kartų.
ultravioletinė mikroskopija . Ultravioletinės šviesos bangos ilgis yra 0,2 µm, todėl ultravioletinio mikroskopo skiriamoji geba yra 0,1 µm, tačiau kadangi ultravioletinė spinduliuotė yra nematoma, tiriamam objektui stebėti reikalingas liuminescencinis ekranas.
Fluorescencinė (liuminescencinė) mikroskopija. Trumpųjų bangų (nematoma) spinduliuotė, sugerta daugybės medžiagų, sužadina jų elektronus, kurie skleidžia ilgesnio bangos ilgio šviesą, tapdami matoma spektro dalimi. Taigi pasiekiama mikroskopo skiriamoji geba.
Fazinė kontrastinė mikroskopija leidžia skleisti nespalvotus objektus.
Poliarizacinė mikroskopija naudojamas tiriant histologinių struktūrų, pavyzdžiui, kolageno skaidulų, architektoniką.
elektroninė mikroskopija leidžia tyrinėti dešimtis tūkstančių kartų padidintus objektus.
Mikrofotografija ir mikrofilmografija . Šie metodai leidžia tirti fiksuotus objektus nuotraukose ir gyvus mikroskopinius objektus, judančius.
Kokybinio ir kiekybinio tyrimo metodai.
Histo –ir citochemija , įskaitant kiekybinę, leidžia atlikti kokybinę tiriamų objektų analizę audinių, ląstelių ir tarpląsteliniame lygmenyse.
Citospektrofotometrija Tai leidžia ištirti tam tikrų biologinių medžiagų kiekybinį kiekį ląstelėse ir audiniuose, remiantis tam tikro bangos ilgio šviesos sugertimi su jomis susijusiais dažais.
Diferencinė centrifuga leidžia atskirti ląstelių, kurios viena nuo kitos skiriasi savo mase, turinį.
Radiografija Jis pagrįstas radioaktyviosios etiketės (pavyzdžiui, radioaktyvaus jodo, H³-timidino ir kt.) įtraukimu į medžiagų apykaitos procesą.
Morfometrija leidžia išmatuoti ląstelių, jų branduolių ir organelių plotus ir tūrius naudojant okuliarus – ir objektinius mikrometrus bei specialius tinklelius.
Kompiuterinė programa automatiniam skaitmeninės medžiagos apdorojimui.
Audinių kultūros metodas yra ląstelių ir audinių gyvybingumo ir dalijimosi palaikymas už kūno ribų. Tam naudojami specialūs konteineriai su maistine terpe, kuriuose sukuriamos visos būtinos sąlygos ląstelių gyvybinei veiklai. Taikant šį metodą galima ištirti ląstelių diferenciaciją ir funkcinį vystymąsi, jų piktybinės transformacijos dėsningumus ir naviko proceso vystymąsi, tarpląstelinę sąveiką, virusų ir mikroorganizmų žalą ląstelėms ir audiniams, vaistų poveikį medžiagų apykaitai. procesai ląstelėse ir audiniuose ir kt.
Intravitalinis (gyvybinis) dažymas naudojamas tiriant fagocitozės reiškinius ir makrofagų aktyvumą, inkstų kanalėlių filtravimo pajėgumą ir kt.
Audinių transplantacijos metodas. Šis metodas naudojamas tiriant ląstelių elgseną ir jų morfofunkcinę būseną, kai jos persodinamos į kitą organizmą. Pavyzdžiui, šis metodas taikomas gyvuliams laikyti mirtinomis radiacijos dozėmis.
Mikromanipuliacija.Šis metodas buvo naudojamas molekulinėje biologijoje, genų inžinerijoje, taip pat klonuojant, kai iš kiaušinėlio su mikromanipuliatoriumi pašalinamas branduolys su haploidiniu chromosomų rinkiniu ir į jį persodinamas somatinės ląstelės branduolys su diploidiniu chromosomų rinkiniu.
Egzistuoja daug tyrimo metodų, tarp kurių išsiskiria: gyvų embrionų stebėjimas naudojant filmą ir vaizdo įrašą (naudojamas daugiausia eksperimente). Tam naudojamas specialus mikrofotografinis prietaisas, kuris yra prijungtas prie terminės kameros, kurioje vystosi embrionas. Pavyzdžiui, tirdami vištienos embriono vystymąsi, kiaute darote langą, kuris uždaromas permatoma plokštele. Šis metodas leido atsekti ir patikslinti embrionų formos ir dydžio pokyčių dinamiką vystymosi procese.
Fiksuoto pjūvio metodas embrionai naudojant šviesos ir elektronų mikroskopiją, historadioautografiją, histo- ir imunocitochemiją. Šie metodai leidžia analizuoti audinių ir tarpląstelinius embriono dalių vystymosi dinamikos pokyčius. Histo- ir imunocitocheminių metodų pagalba tiriami embrioninėse ląstelėse vykstantys biocheminiai procesai - DNR, RNR, baltymų, specifinių receptorių baltymų ir kt. sintezė. Taikant šiuos metodus, buvo gauta svarbi informacija apie ląstelių ir audinių diferenciaciją vystantis. embrionų ir vaisių.
Žymėjimo metodas 1925 m. pasiūlytas W. Vogtas (1888-1941), leidžia ištirti ląstelių judėjimą besivystančiame embrione. Tam naudojami embrionams netoksiški žymekliai (pavyzdžiui, neutrali raudona, anglies dalelės), taip pat antikūnai prieš tam tikrus baltymus. Naudojant antikūnus, naudojamas jų gebėjimas derintis su fluorescenciniais dažais ir gemalo baltymais. Fluorescencinės mikroskopijos pagalba atsekamas dažų pasiskirstymas ir tiriama baltymų sintezės dinamika besivystančiose embriono audiniuose.
Mikrochirurgijos metodai pradžioje sukūrė G. Spemanno (1869-1941) mokyklos atstovai. Jie apėmė: gyvūnų kiaušinėlių lukštų pašalinimą, vieno embriono dalių persodinimą į kitą ir kt. Šie metodai taip pat naudojami tiriant embriono dalių ar jo individų sunaikinimo (pavyzdžiui, naudojant lazerio spindulį) pasekmes. ląstelės. Transplantacija kaip tam tikra mikrochirurgija naudojama ląstelių migracijos keliams ir audinių vystymosi šaltiniams nustatyti. Tuo pačiu metu embriono vieta, pavyzdžiui, putpelės, persodinama į tą pačią vištienos embriono vietą vietoje atokios vietos. Putpelių ląstelių branduoliai turi būdingą struktūrą, todėl juos galima atskirti nuo vištienos embriono ląstelių branduolių.
paaiškinimas- nedidelio embriono ploto iškirpimas ir jo auginimas dirbtinėje aplinkoje. Naudojant šį metodą, galima gauti informacijos apie audinių vystymosi šaltinius iš tam tikros embriono srities ir nustatyti histogenetinius vystymosi modelius.
Branduolinė transplantacija- embrionų klonavimo metodas. Pavyzdžiui, persodinus letenėto varlės buožgalvio žarnyno epitelio ląstelių branduolius į varlės kiaušinį, kurio branduolį inaktyvavo ultravioletinis spindulys, atsirado naujų individų (Gerdono eksperimentai). Šie eksperimentai padėjo pagrindą aukštesniųjų stuburinių klonavimui ir prisidėjo prie garsiosios avies Dolly atsiradimo (1997 m.). Panašūs embriologiniai eksperimentai įtikinamai parodė, kad somatinių ląstelių branduoliuose yra pilnas genetinės informacijos rinkinys naujam organizmui vystytis.
Naujausias pasiekimas eksperimentinė embriologija buvo apvaisinimo mėgintuvėlyje metodo sukūrimas. In vitro pradėtų embrionų persodinimas į gimdą yra nevaisingumo gydymo pagrindas. 1973 metais L. Shettles (JAV) iš nevaisingos moters kiaušidės pašalino priešovuliacinį kiaušinėlį ir apvaisino ją savo vyro spermatozoidais. Tai buvo žmogaus embrionų persodinimo technikos, skirtos nevaisingumui gydyti, pradžia. Tačiau tik 1978 m. Jungtinėje Karalystėje, sėkmingai persodinus į nevaisingos moters gimdą 8 blastomerų stadijos žmogaus embrionas, po 2,5 paros auginimo, pirmasis pasaulyje „mėgintuvėlis“ svėrė vaikas. Pasirodė 2700 g.